BM-cycline消除支原体
支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。

对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。

去除支原体常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。

一、 BM-cycline 的成分和原理
BM-cycline包括泰妙菌素（泰妙霉素 Tiamulin 或pleuromulin即BM-cyclineⅠ）和二甲胺四环素（米诺环素Minocycline 即BM-cyclineⅡ）。

抑制支原体及细菌生长，高效去除培养细胞中已感染的支原体。

适用于多种培养细胞，无明显副作用，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。

泰妙菌素抑菌原理：泰妙菌素与细菌核糖体的肽基转移酶中心结合，导致多肽链起始复合物不能正确地装配，生理性地失活，易分解，并且不能进入多肽链延长期，从而导致细菌无法合成自身蛋白质。

二甲胺四环素抑菌原理：是与核糖体30S亚基的A位置结合，阻止肽链的延长，从而抑制细菌或其他病原微生物的蛋白质合成。

二、BM-cycline消除支原体的方法
1．抗生素制备
用PBS将BM-cyclineⅠ和Ⅱ配成250×浓缩液,即2500ug/mL和1250 ug/mL,-20℃保存备用，终浓度BM-cyclineⅠ为10 ug/mL、 BM-cyclineⅡ为5 ug/mL，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。

2. 实验步骤
贴壁细胞：
贴壁细胞传代的同时加入BM-cyclineⅠ10 ug/mL，37℃培养3天，胰蛋白酶消化传代，加入BM-cyclineⅡ5 ug/mL，37℃培养3天，继续传代培养，追加BM-cyclineⅡ5 ug/mL培养2-4天后弃药液D-Hank’ s液洗2次，胰蛋白酶消化传代进行常规培养。

悬浮细胞：
取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-cyclineⅠ的培养液培养3天后，悬
浮离心，吸除培养液，再加入含BM-cyclineⅡ的培养液培养4天，如此3-4个循环，每个循环末均用用Hoechst33258(二苯并咪唑，用PBS配制工作浓度为0.05ug/mL)荧光染色镜检。

消除支原体的细胞再不加抗生素的培养液中传代3-4次即可获得纯净的无支原体污染的细胞。

如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除，也有只进行一个BM-cyclineⅠ和BM-cyclineⅡ循环，就能去除支原体的）。

BM-cyclineⅠ和BM-cycline Ⅱ与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含CIP的培养液培养12天后，再按上述方法处理。

（DNA荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。

具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。

染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。

镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

）商品：
Roche 货号：10799050001 品名 BM-Cycline 每包装(37.5mg) 可用于2 X 2.5升培养基。

三、扩展内容
1、造成支原体高污染率的原因为：
▪支原体size 0.1-0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
▪支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
▪缺乏简单、快速且可靠的检测方式
▪细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
▪研究或操作人员忽略污染问题
2、支原体污染了来源：
▪已受污染的细胞
▪操作人员的疏失
▪已受污染的培养基、血清
▪操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十
分注意。

而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。

3、支原体的检测方法：
检测方法：1、相差显微镜检测；2、低张处理地衣红染色观察；3、 DNA荧光染色法；4、电镜检测；5、 3-H胸腺嘧啶掺入法；6、聚合酶链反映法；7、免疫学方法；8、支原体的培养。

还查到一种快速检测支原体感染的方法——瓜氨酸检测法，当细胞培养被支原体污染时,培养基中精氨酸量明显下降,同时有瓜氨酸出现;当支原体被消除后,瓜氨酸即消失。

用HPLC检测细胞培养中瓜氨酸的含量。

4、去除支原体的方法
抗生素法：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent， ICN），Ciprofloxcin （Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
共培养法：与巨噬细胞共培养。

重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4-5周后，重复克隆2次。

过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤，去除效果不好。

5、预防与控制方面可从以下各点加强注意：
设备方面：
1、使用已作支原体测试后的细胞株
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。

实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求。