重组亚单位疫苗构建流程
保护性抗原的基因
原核或真核表达载体
原核或真核细胞 保护性抗原肽链
佐剂
重组亚单位疫苗
图 原核表达载体pGEXIFN-α重组路线图
用含EcoRI和NotI酶切位点的引物扩增PoIFN-α 基因，并将其克隆入pGEM-T Easy 载体 中 亚克隆
EcoRI和NotI双酶切
EcoRI
概念：将病原体的某个或某些基因（复制非必需的，或与毒力 相关的）全部或部分删除，使其毒力下降，但仍然保留一定的 复制能力。
特点：缺失与毒力相关基因及病毒复制非必需的基因是发展活 疫苗的理想途径之一。由于毒力相关基因的缺失导致病毒致病 力的减弱，但仍然保持其良好的免疫原性。这种基因缺失的病 毒作为疫苗的突出优点是不易返祖而重新获得毒力。缺失的基 因可作为一种遗传标志用于建立鉴别诊断方法。 。 实例：伪狂犬病毒基因缺失标记疫苗，牛传染性鼻气管炎病毒 基因缺失标记疫苗，Nef基因缺失的猴免疫缺陷病毒，Vif基因 缺失的猫免疫缺陷病毒，P39基因缺失的布氏杆菌疫苗，R3/G4 基因缺失的牛白血病病毒，……
2.质粒
质粒是细菌质粒(Plasmid)是指细菌细胞质中独立于 染色体外的、能够自主复制的遗传单位，是环状双链 DAN小分子,它能够随着细胞的增殖而稳定地遗传给 子代细胞。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞所编码 的蛋白质和酶，是胞质复制子。质粒不是细菌生长、 繁殖所必须的结构。质粒对宿主细胞没有干扰，此不 同于病毒和噬菌体.质粒的复制与染色体是同步的， 而且其拷贝数是恒定的，分配给每个子细胞的质粒拷 贝数也是相同的.
●合成肽疫苗：人工合成保护性抗原蛋白的部分肽段 ●转基因植物可食疫苗：利用植物表达病原的保护性抗原蛋白
抗原： 重组抗原、核酸探针、基因芯片技术、PCR技术,
抗体： 基因工程抗体制造技术，如生物导弹（可以治疗肿瘤）、 将抗体基因与毒素基因连接后进行表达。
遗传信息的传递和表达
中心法则
基本概念
1.基因工程载体 目的外源基因分离后是无法自主进入到宿主细胞 并进行复制表达的,必须有一运载工具将其运达宿主 细胞才能复制、扩增、传代和表达.这种将外源目的 基因带入宿主细胞并与其一起复制、表达的基因运 载工具就叫做基因载体或基因工程载体.本质上所有 基因载体都是DNA.外源基因都是插入到载体DNA的序 列中，然后随载体进入宿主细胞，并随载体的复制 而复制或表达.
技术路线
纯化PRV 提取PRV基因组 经sph1、kpn1酶切 含gG、gD、gE基因 质粒PAcGFP-C1 质粒PUSK
死疫苗
完整病原体疫苗 蛋白基础疫苗 肽基础疫苗 多糖基础疫苗
DNA疫苗
“Naked” DNA Viral delivery
重组病毒载体
经典策略--细菌 重组细菌 重组细菌载体
Bacterial delivery
抗独特型疫苗
根据疫苗抗原的性质和制备工艺
经典策略活疫苗
• 在细胞上培养减毒 • 分离异源变异病毒株 • Resorted Genomes
通过基因工程技术，将病原微生物致病性基因进行修 饰、突变或缺失，从而获得弱毒株，研制成疫苗。
重组病毒构建原理
1.同源重组法
2.从cDNA克隆拯救感染性病毒
重组病毒构建原理（I)
野病毒基因 弱毒病毒基因 非毒力基因鉴定
克隆该关键基因至质粒
将该关键基因与野毒株 基因结合 稳定低毒力基因
基因缺失疫苗
生物制品制造新技术
第一节 基因工程疫苗
基因工程疫苗主要是指用重组DNA技术研制的疫 苗，包括将保护性抗原基因在原核或真核载体细胞中 的重组亚单位疫苗，以及以某些病毒或细菌为外源基 因载体的活载体疫苗和通过基因组突变、缺失或插入 的基因缺失疫苗，以及重组DNA疫苗等。
疫 苗 分 类
活疫苗
经典策略--病毒 重组病毒
重组亚单位疫苗
概念：将病原的主要保护性抗原蛋白基因在体外进行大量表达， 纯化其表达产物辅以佐剂制成疫苗----亚单位疫苗。 特点：利用体外表达系统（如大肠杆菌，杆状病毒，酵母等）大 量表达病毒的主要保护性抗原蛋白作为亚单位疫苗不仅具有良好 的安全性和稳定性，而且便于规模化生产。利用非疫苗用蛋白作 为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然 感染的动物。 适用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。 如：猪瘟，高致病力禽流感，新城疫，传染性法氏囊病等。 不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有ADE效 应的疾病。如：人类爱滋病，动物慢病毒病（马传贫，山羊关节 炎脑炎等），动脉炎科病毒（猪繁殖与呼吸综合征等）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3. 多糖基础疫苗
4. 抗独特型抗体
不同疫苗特性比较
活疫苗
• 可在宿主细胞中复 制 • 毒力降低 • 免疫反应比较全面 • 免疫剂量小 • 免疫保护期长

死疫苗

DNA疫苗



不能在宿主细胞 • 可刺接抗原在细 中复制 胞内合成 无毒，不返强 免疫反应不太全面 • 可诱导细胞免疫 不会传染给其它 • 制备技术容易标 个体 准化 制备技术相对容易
基因工程疫苗种类
重组疫苗（基因缺失疫苗） 重组载活体疫苗
重组亚单位疫苗
转基因植物疫苗
“标记”疫苗
基因疫苗
基因添加疫苗
疫苗： ●重组亚单位疫苗：将病毒或细菌的主要保护性抗原基因在 体外大量表达 ●活载体疫苗：病毒或细菌载体+外源基因 ●基因缺失苗：删除毒力相关，但对病原复制非必需的基因 ●DNA疫苗（肿瘤疫苗） ：质粒+真核启动子+外源基因
NotI
EcoRI和NotI双酶切
EcoRI
NotI
T4连接酶连接
图 原核表达载体pETIFN-α 重组路线图 重组质粒pGEM-T-IFN-α Z 亚克隆
EcoRI PstI
EcoRI和PstI双酶
EcoRI和PstI双酶 EcoRI PstI
T4连接酶连接
重组活疫苗（recombinant live vaccine）
• 筛选温度敏感突变株
死 疫 苗
1. 完整病原体疫苗 （细菌、病毒） 2. 蛋白基础疫苗(Protein-based Vaccine)
•
• • • •
天然蛋白
化学灭活蛋白 基因灭活(重组突变) 重组多肽 (HBsAg, VLPs of papillomavirus) Carrier (酵母Ty颗粒)