高级生物化学蛋白 质性质和分离
一、蛋白质的变性与复性 P233
1. 蛋白质变性的概念 Denaturation 蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其
特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构 变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改 变和生物活性的丧失。 2. 变性的本质
次级键（有时包括二硫 键）被破坏，天然构象 解体。变性不涉及一级 结构的破坏
比较DNA和蛋白质变性的异同-2012中南大学生物化学
4、 DNA的熔解温度（Tm）
DNA的变性是爆 发式的，变性作 用发生在一个很 窄的温度范围内。
Tm
DNA的熔解温度（Tm）：
（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应 的温度。
变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆 积，使Tm下降。 DNA的Tm一般在82—95℃之间
OD260增高 比旋度下降
酸碱滴定曲线改变
粘度下降 浮力密度升高 生物活性丧失
DNA的变性是爆发式的
增色效应
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。 DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基
础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。 变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫 外吸收，故产生增色效应。
Cot1/2＝１/K，即复性一半时的Cot值. （2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA 的Cot1/2值是不同的
与k值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响K值． DNA分子序列的复杂性（X值）：
(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值．
如（ATATAT）,其X值为2,（ATGC）（ATGC）n 的X值为4．
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程 称为退火(annealing) 。
2 DNA复性后的理化性质变化
减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低 粘度上升 浮力 密度降低 生物活性部分恢复
影响复性的因素
热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，
4. 变性的因素
① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波 ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。
（如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）
常用的变性剂：尿素
尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水 中的溶解度，从而降低疏水相互作用。
尿素或者胍
变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）
5、变性蛋白质的特性
• 生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变 性失去催化作用。
• 物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，密度降低， 失去结晶能力，旋光值改变，光谱发生变化。(分子量 不变）
• 化学性质改变，如结构的伸展松散而暴露，易与化学试 剂反应，易为蛋白质水解酶所分解。
制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
思考题
1. 酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释 原因？-2012年山东大学生物化学
2. 二硫键多蛋白质难变性 3. 胶原蛋白有特殊共价键 4. 纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？ 5、一般的酶都是低温保存，但低温不稳定性酶在低
温时变性，推测其机理。-2012年中山源自学生物化学 6. 酶敏感性的概念 ？
2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释 3、举例：
• 有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一 定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。
牛胰核糖核酸酶变性和复性
DNA的复性
1 DNA复性(renaturation)的定义
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性。
-江南大学2009年生物化学
思考题
蛋白质变性后的现象
-2011四川大学生物化学
核酸的变性
P508
(一)、DNA的变性(denaturation)
1 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。
2 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、
酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等
3 变性后其它理化性质变化：
越远离此温度，复性速度就越慢
① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑
复性速度与DNA的浓度成正比 ⑤ 环状DNA易复性
复性速度可用Co·t衡量
Cot1/2值： （1）概念：当C/CO＝１/2时的Cot值定义为Cot1/2值，
变性理论和变性的因素
3.变性理论
1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后， 其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这 就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构 是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的 和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。
不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后， 其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的 DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。
假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变 性后A260nm上升30%以上
DNA和蛋白质变性的比较
DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降， 其过程不可逆。DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键 完好，一般是可逆的。
（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素: ① DNA均一性： ② G-C含量： G-C含量与Tm值成正比。 ③ 介质中离子强度：
7、蛋白质的复性
1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后， 可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分 恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 这种变性也称为可逆变性。
思考题
➢ 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 ➢ 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫
苗等）的必要条件。 ➢ 误服重金属解毒方式 ? ➢ 长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物 ？ ➢ 一种发生在蛋白质内部的Ala-Val突变导致蛋白质丧失活
性，然而，如果这种蛋白质在第二位置发生Ile-Gly的突 变，可使蛋白质恢复活性，试提出一种合理的解释。