哪些物质，有什么用？
目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 1. 蒸馏水的作用是______________________________ 。 溶解红细胞的细胞膜 2. 加入甲苯的作用是____________________________ 。 加速红细胞的破裂 3. 充分搅拌的目的是____________________________。
血液组成成分 阅读思考： 血浆 和________ 血细胞两部分组成。 1. 血液由______
红细胞 细胞数量最多，细胞的含量 2. 血细胞中________ 血红蛋白 。 最高的化合物是_____________ 2条α-肽链 和____________ 2条β -肽链 构 3. 该化合物是由 _____________ 成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和 亚铁血红素 CO2结合的 ______________________基团。
4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液， 其作用主要是( C ) A.使酶的活性最高 B.使蛋白质的活性最高 C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷
5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异
总结：大分子经过路程短，流动快； 小分子经过路程长，流动慢。
4、具体过程
混合物 上 柱 洗脱：
洗 脱
大分子流动快 小分子流动慢
收 集 大分子
收 集 小分子
从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
2．凝胶电泳法： 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、 分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、 方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方 向和运动速度不同。
课题3
血红蛋白的提取和分离
一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的 提取和分离，理解色谱法、电泳法 二、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填
思考：
“课题1--DNA的粗提取与鉴定” 实验理想的材 料是什么？ “课题3--血红蛋白的提取和分离” 这实验理想的材料又是什么？原因是？ 答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞 无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。
注意：
（1）凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀；凝胶装填时 尽量紧密；装填时不能有气泡存在：因为气泡会 搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密
3.样品的加入和洗脱
注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象， 否则重新填装。
1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集
影响蛋白质分子运动速度的因素 决定 运动方向 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ 决定 运动速率
缓冲溶液－－洗脱剂
（1）作用： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 （2）配制： 由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 （3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？ 目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境， 保：洗涤的目的是什么？ 洗涤的方法是什么？
洗涤干净的标志是什么？
3g柠檬酸钠
吸出血浆 5倍体积生理盐水
血液 100mL
低速短时 间离心
血浆 红细胞 红细胞
搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
2.释放血红蛋白
阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了
一、基础知识：
（一）蛋白质分离原理
（二）蛋白质分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法
（三）缓冲液的作用
二、实验操作－－实验步骤 注意事项 血液组成成分 1、样品 处理 （1）洗 涤 红 细 胞 （2）释放血红蛋白
（3）分离血红蛋白
2、粗分离 3、纯化 4、纯度鉴定 （4）透析血红蛋白
缓冲液 凝胶
1.调液面
2.加样
3.再调液面
4.洗脱 、 5.收集
注意事项
1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
2. 凝胶的预处理：
沸水浴法，还能除去微生物和气泡 3.色谱柱的装填： 装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
知识总结
血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 凝胶电泳法 缓冲溶液 原 理 分离过程 作用
6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作， 其中正确的是（ A ） • A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞 • C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原 因是 A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果 B、气泡阻碍蛋白质的运动 C、气泡与蛋白质发生化学反应 D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
3.分离血红蛋白
分离过程 红细胞 混合液 高速离心 10min
离心 管
脂类物质 有机溶剂
滤纸
血红蛋白
过滤
烧杯
4.透析血红蛋白
透析的目的是什么？
去除血红蛋白中的小分子杂质
1mL
1mL 20mmol/L磷酸缓冲液
纯化－－凝胶色谱法 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 3.样品的加入和洗脱 教材图5－19
3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时， （相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入凝 胶内部的通道，路程（ 较长），移动速度 （ 较慢 ），而（相对分子质量较大）的 蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 （ 凝胶外部）移动，路程（ 较短 ），移 动速度（ 较快 ），相对分子质量不同的 蛋白质因此得以分离。
组 成
样品处理 蛋白质的
提取分离
粗 分 离 纯化 纯度鉴定
练习巩固
1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋 白质的叙述，正确的是 A、 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对 分子质量较大的蛋白质 B、 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对 分子质量较大的蛋白质 C、 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对 分子质量较大的蛋白质 D、 二者根本无法比较
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同 时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利 用相关计算公式算出相对分子量 SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质 间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子 大小。
2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个 B
3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用 的共同点是( A ) A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C.将酶或细胞固定在凝胶中 D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
凝胶色谱法进行纯化
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度
蛋白质提取与分离的依据－－
蛋白质的物理化学性质差异：
1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力
1.凝胶色谱法 （1）凝胶 一些微小多孔的球体 （内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子 筛） （2）概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法
9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝 胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的 顶端，不要破坏凝胶面