1) DNA分子大小
1 （V：迁移速率 V= logN
2) DNA构象：
N：碱基对数目）
一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。 3) 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加 电压成正比。
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4) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不 同范围的DNA
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 分离范围（kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
常用的是琼脂糖凝胶电泳，其优点主要在于操作简单、快速、
灵敏。 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA、RNA分子混合 物的方法，以琼脂糖作为支持介质，利用DNA分子在泳动时的 电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的
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实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于
向电泳槽中加入0.5x电泳缓冲液至刚没 过凝胶表面1~2mm
（2）点样：吸取5ul的DNA样品，点在点样 板上，再吸取6 ×上样缓冲液1ul， 混匀后， 用微量加样枪小心加入样品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导 致样品外溢。
（3）电泳：打开电源开关，调节电压至80V, 可见到溴酚 蓝条带由负极向正极移动，约25分钟即可观察结果。根据 指示剂泳动的位臵，判断是否终止电泳（当溴酚蓝染料移 动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳）。
5) 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率。
6) 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离
子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔 化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE， 1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
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注意事项
1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否 则温度太高会使制板变形；
胶
待凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml，混匀
铺
胶
c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将 混匀后的琼脂糖倒入其中，直至厚度为4～6 mm， 在室温下冷却至其凝固(约30~ 45 min)
凝胶凝固后取出梳子
d. 小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将 胶板臵于电泳槽中。
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子 电泳槽 移液枪
Loading Buffer
试剂
琼脂糖Agarose（AG）：从石花菜及其他红藻 类植物提取出来的一种线状高聚物，由1,3连结的 β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连 接起来的长链构，是琼脂中不带电荷的中性组成 成份，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解， 温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶
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（4）观察： 将电泳好的胶臵于凝胶成像系统上，打开紫外灯
，可见橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计样品 DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则 可通过线性DNA条带的相对位臵初步估计样品的分子量。
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附 注：
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
琼脂糖的浓度。
在 pH 值为 8.0～8.3 时， DNA分子主要带负电荷， 在外加电场作用下向正极泳动。采用适当浓度的凝胶介 质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到
分离核酸片段检测其大小的目的。
。
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主要实验器材
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光
试剂
上样缓冲液（ Loading Buffer）：0.25％溴酚兰；0.25 核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝 ％二甲苯青； 30blue, ％甘油水溶液 （ bromophenol Bb）呈蓝紫色；二甲苯青 （xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚 作用： 蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢 ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀 沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电 泳的速度和位臵 ③使样品呈色，使加样操作更方便
2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖
直向上，不要弄坏点样孔； 3 、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不 要刺穿凝胶； 4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，
胶勿乱扔；
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实验操作
制备琼脂凝胶 加样 电泳 紫外透射仪检测
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操作步骤
（1）制胶（以30 mL1%琼脂糖凝胶的为例） a. 称取0.3 g 琼脂糖，加入30 ml 的1×电泳缓冲液摇匀；
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溶
b. 加热至琼脂糖完 全溶解（要防止过 热溢出）；
琼脂糖凝胶电泳检定 质粒DNA
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带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一般分
为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳不需支持物， 这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则需用各种类型的物质 作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性 支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最
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试剂
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，是一种荧光染
料。EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外
线激发下，发出桔红色荧光,荧光强度与DNA的含量
成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
同时EB也是强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少
台面污染。
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分 子实 生验 物 学来自试剂TAE TBE 是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其 的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用 电泳缓冲液：指在进行分子电泳时所使用的 中电泳时更符合实际相对分子质量（ TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果 TBE中电泳时测 缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电 更好。 TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用， 出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线 状 DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约 10%， 并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基 泳缓冲液有： TAE、TBE等 电泳大于 硼酸盐复合物而使 13kb的片段时用 DNA片段的回收率降低，所以不 TAE缓冲液将取得更好的分 离效果，此外，回收 宜在回收电泳中使用。 DNA片段时也易用TAE缓冲系统 进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳 （如过夜）不可选用，除非有循环装臵使两极的缓冲 液得到交换。