山东大学实验报告2012年12 月姓名系年级2011级生科2班组别四同组者科目微生物学实验题目微生物的土壤分离一、【实验题目】微生物的土壤分离二、【实验目的】1. 从各地区的土样中筛选含果胶酶的菌株和产几丁质酶的菌株。

2.熟悉菌株筛选的具体操作流程。

3. 根据菌落形态，染色结果，运动性等来鉴定未知细菌；小室培养法观察未定未知真菌。

4.掌握菌株筛选、分离纯化、鉴定等具体操作流程。

5．复习本学期所学的微生物实验的相关的操作步骤，并进一步强化无菌操作的概念。

三、【实验试剂与器材】1.土样：7号土样2.菌种：革兰氏染色：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌3.试剂及培养基培养基：几丁质酶筛选培养基；液体PDA培养基；固体PDA斜面培养基；几丁质酶发酵培养基；果胶酶筛选培养基；果胶酶液体种子培养基、发酵产酶培养基；固体斜面培养基、半固体牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、吲哚培养基、甲基红培养基试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇5%孔雀绿水溶液、氯化钠、刚果红、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水4.仪器显微镜、锥形瓶、培养皿、试管、试管架、移液管、移液枪、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、刮刀、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布、双层瓶等四、【实验原理】1．微生物的分离和纯化在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。

土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株2．与果胶酶有关的（1）果胶：果胶是一组聚半乳糖醛酸，在适宜条件下其溶液能形成胶和部分发生甲氧基化（甲酯化，也就是形成甲醇酯），其主要成分是部分甲酯化的a(l,4)一D一聚半乳糖醛酸，残留的羧基单元以游离酸的形式存在或形成铵、钾钠和钙等盐。

（2）果胶酶：是分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。

通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。

天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。

（3）产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌等。

3．DNS法测果胶酶的酶活的原理根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，而半乳糖醛酸是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。

4．产果胶酶菌株的筛选原理（1）菌种的筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选模型。

（2）配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。

刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。

当果胶被果胶分解菌分泌的果胶酶分解后，刚果红-果胶的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以果胶分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选果胶分解菌。

5.与几丁质酶有关的（1）几丁质：几丁质是由N一乙酰．D．氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的高分子聚合物, 能产生几丁质酶的生物很多，包括植物，动物和微生物。

虽然几丁质酶产生生物很多，但在筛选几丁质酶时往往集中于微生物上．（2）几丁质酶：关于几丁质酶这一概念目前用得比较混乱，广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，还包括脱乙酰酶，壳聚糖酶，几丁寡糖酶，几丁二糖酶等，狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N．乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。

（3）传统的筛选方法主要有两种，一是在胶体几丁质琼脂培养基上看透明圈的大小及清晰程度；二是水解几丁质荧光类似物的方法．这两种方法的优点是快速直观，缺点是透明圈法选得的是那些能分泌并扩散至周围环境中的几丁质酶，对胞内酶产生菌不能被检出；而水解类似物法只简单地反映了降解小分子寡聚物的能力，至于这些酶是否能水解大分子几丁质却不得而知．6．DNS试剂测几丁质酶酶活的原理DNS法也叫做3,5-二硝基水杨酸定糖法。

其原理是利用3,5-二硝基水杨酸试剂在碱性介质中与还原糖共沸，被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，其颜色深浅与糖类有利出还原集团的数量有关，通过比色法在540nm波长下测定反应液的OD 值来计算还原糖的量。

这种测定方法的主要优点是廉价，但灵敏度低，因而不适用于坚定几丁质讲解能力较弱的菌株。

目前,在微生物产几丁质酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等糖苷水解酶类的研究过程中,一般是通过DNS试剂测定酶与底物反应生成的还原糖的量来反映酶活力的高低7．平板菌落计数法菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。

因此平板菌落计数的结果往往偏低。

8．平板划线分离法平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。

为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。

9．革兰氏染色革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G-两大类群，常用的复染液是番红。

经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色细菌为革兰氏阴性菌。

如下图所示10．芽孢染色芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。

利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。

再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。

在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。

芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形，细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。

11.微生物的生理生化反应在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

（1）淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。

(2) 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。