1.注射抗原的目的是什么?
2.诱导其融合的方法有哪些？
3.融合后培养液中有几种细胞?
4.怎样筛选出杂交瘤细胞，杂 交瘤细胞有何优点?原因？
5.怎样筛选出能产生所需单一 抗体的杂交瘤?
6.大量增殖杂交瘤细胞和获得 单抗的方法?
7.体内培养有什么优点？
问题探讨：
1）该过程利用了哪些技术？ 免疫技术，细胞融合技术和动物细胞培养技术
A．一类特殊抗体
B．无性繁殖系
C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体
D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体
(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是___有__丝__分裂，其遗传性状___不__变_____。
(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并
与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了
一、动物细胞融合
1、定义：指用自然或人工方 法使两个或多个不同的细胞 融合成一个细胞的过程。
◆细胞杂交：不同基因型的细胞 之间的融合就是细胞杂交。
◆杂种细胞：融合后形成的具有 原来两个或多个细胞遗传信息的 单核细胞称为杂种细胞。
细胞融合是正常的生命活动
受精作用
两个细胞正在融合
动物 细胞 融合
2、诱导融合的因素 生物法：灭活的病毒诱导融合. 化学法：聚乙二醇PEG诱导融合. 物理法：电激融合
这种方法的缺点是什么?
产量低，纯度低，特异性差。
动物体内产生的抗体多达数百万种,但每一个Ｂ淋巴细胞只分泌 一种特异性抗体。设想怎样获得单一类型的抗体？
能否用单个B淋巴细胞通过无性繁殖(克隆)形成的细胞群来产生 单一类型的抗体(即单克隆抗体)呢？
B淋巴细胞在体外不能无限增殖。
单克隆抗体的制备—极富创造性的方案
5、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定选择培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ C ）
①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞
A． ②④ C． ①②③④
B．①③⑤ D．②③
_______抗__体__能__与抗原发生特异性结合的特点
。
例题2
（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，
将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ BCD ）
A．T淋巴细胞 B．效应B淋巴细胞
C．抗体
D．记忆细胞
（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，
正确的是 (多选)
（ ACD ）
A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台
病毒颗粒黏 附细胞表面 细胞膜被 病毒颗粒穿通
细胞膜连接 细胞融合、形成杂种细胞
3、动物细胞融合技术的应用
细胞融合技术突破了有性杂交的局限， 使远缘杂交成为可能。
利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。
二：动物细胞融合的成功应用 思考 ——单克隆抗体的制备
传统方法是怎样获得抗体的?
将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体.(B细胞受抗原刺激,增殖 分化形成浆细胞,产生抗体.)
单克隆抗体:用单个B淋巴细胞通过无性繁殖(克隆)形成 的细胞群产生的单一类型的抗体. 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖 能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交 瘤细胞既能在体外无限增殖，又能持续分泌成分单一的 特异性抗体。
米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔 生理学奖。
交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G,B3G--BnG。而B,G,BB,GG在此培养基上不能存活。） E、第二次筛选(有限稀释法):在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ， 每孔只放一个杂交瘤细胞。 “克隆化培养”每个杂交瘤细胞， 并 进行“专一抗体检测”，检测阳性的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。 F、选择所需要的杂交瘤,克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。 G、提取单克隆抗体。
1975年，英国剑桥大学分子生物 学实验室的科勒和米尔斯坦，把小 鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的 骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤 细胞，实现在体外大量生产抗体的 目的。实验过程如图所示。
(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”
在一起，说明细胞膜 具有一定的流动性 。
(2)单克隆抗体的准确定义应为 ( C )
病毒或聚乙二醇诱导
B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克
隆抗体
C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不
能无限增殖
D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，
优越性明显
已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。 人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨 髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在 试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
2）为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？ 融合成的杂交瘤细胞，既具有B细胞分泌抗体的能 力，又有骨髓瘤无限增殖的本领，因而可以获得大 量单克隆抗体.
3）两次筛选目的什么？ 第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。 第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
4）如何进行第2次筛选？ 有限稀释法:稀释后涂布在多孔培养板上，使每孔最 多含有一个杂交瘤细胞,让其在孔中增殖。再用特定 的抗原检测各孔上清液中产生的抗体.阳性孔(有抗原 抗体反应) 中的细胞即为能产生单一抗体的杂交瘤.
2、单克隆抗体的制备过程
产生相应的 效应B细胞
注射特定 抗原蛋白
效应B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
培养骨髓瘤细胞
诱导融合
只考虑两两融合,
培养液中细胞有
多种杂交细胞
骨髓几瘤种细类胞型-？--融骨合髓瘤细胞
细胞几种类型？
B淋巴细胞--- B淋巴细胞
第2次筛选：目的：在 杂交瘤细胞中筛选出 能产生所需单一抗体 的杂交瘤细胞 方法： 克隆化培养；专一抗 体检测
承__双__亲__细__胞___的遗传特性，既能 _分__泌__抗__体___,又能__无__限__增__殖___。
体外培养
注射到
5、C过程指细胞培养，该过程包括
小鼠腹腔
_原__代__培养和_传__代__培养两个阶段，其
中__5_0__代以内的的细胞属于细胞株。
1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到 杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨
例题3：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤 风杆菌单克隆抗体的实验方案 A
1、该实验方案的目的是_制__备__单__克__隆_ 抗体 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？
骨髓瘤细胞 B
杂交瘤细胞
3、A是从小鼠的脾脏中取得
C
__B_细__胞__,该细胞能够产生_抗__体___
4、图中B为_细__胞__融__合_过程，常用 足够数量的细胞群 _灭__活__病__毒__作为诱导剂，该细胞继
髓瘤细胞融合的是（ A ）
A.经过免疫的B淋巴细胞
B.没经过免疫的T淋巴细胞 C.经过免疫的T淋巴细胞
D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞
2..动物细胞融合的目的中最重要的是----------------（ B ）
A.克服远缘杂交不亲和
B. 制备单克隆抗体
C.培育新品种
D.生产杂种细胞
3.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是
（D ）
A. 诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术手段基本相同
C. 所采用的原理完全相同 D. 都能形成杂种细胞
4. 单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是------（ D ）
A.由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合 B.由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成 C.由小鼠一个B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成 D.由小鼠一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成
3.单克隆抗体的应用
阅读P54中下段,自己归纳要点: 1)、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。
2)、单克隆抗体的应用:
A、作为诊断试剂：能识别各种抗原的细微差别(特异 性强，灵敏度高).具有准确、高效、简易、快速特点.
B、用于治疗疾病(癌症)和运载药物：(生物导弹)
单克隆抗体+放射性同位素+化学药物(或细胞毒素)
（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。 （2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出
杂种细胞，并说原理。
方法： 培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。 原理：加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D
合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不 能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S 途径合成DNA而增殖
①节约培养基
体外培养
②容易控制培养条件
特异性强，灵敏度高，单克Βιβλιοθήκη 抗体单克隆抗体 可以大量制备。
单抗的制备过程要点：
A、注射抗原,对动物特异性免疫 B、分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一
个系列（B1,B2,B3,---Bn）。 C、细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG） D、第一次筛选：在“选择培养基”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂
（定位导向) (检测)
(杀死）
比较植物体细胞杂交和动物细胞融合
比较项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
原理 融合前处理 诱 导方法
细胞膜的流动性、 植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
用纤维素酶、 果胶酶去壁
用胰蛋白酶 使细胞分散
物理、化学方法
物理、化学、 生物方法
用
途
获得植株
主要用于制备 单克隆抗体
例题1：
在选择培