cDNA第二链的合成
1、自身引导合成法（经典方法）：首先热或碱处理将cDNA-mRNA杂合分子变 性和RNA降解。然后以3'发夹结构为引物，在DNA聚合酶的作用下合成第二链。 最后用单链特异的S1核酸酶消化双链cDNA中对应于mRNA5&
粘粒(菌落) 酵母人工染色体 (构建高等真核生物基因的提取
采取高丰度mRNA（特定mRNA达细胞总mRNA的半数以上） 对mRNA进行富集或分级分离（方法繁琐) 现多采用cDNA进行富集（琼脂糖凝胶电泳）
载体一般为质粒或视觉提载体
cDNA克隆片段的获得
第一链
第二链
末端处 理
cDNA第一链的合成
以mRNA为模板，反转录酶催化，人工合成的poly T引物80 library）：是用分子克隆的方法将某种生物 或其组织细胞的所有DNA片段插入适当载体，转化适当宿主菌后进行段是基因组DNA，后者的插入片段是以mRNA为模板 合成的互补cDNA。
2、置换合成法（现在采用）：在焦磷酸钠存在下合成cDNA第一链，用RNA酶H 处理杂合分子，使mRNA产生一系列缺口，成为一系列引物，再在大肠杆菌DNA 聚合酶 I的作用下合成第二链。该方法高效、无需纯化杂合分子、不需处理 发夹结构避免cDNA损失
3、PCR合成法（新策略）：在cDNA第一链的3'端加一段oligo C尾为引物，通 过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。这种方法不会丢失末端的少数核苷酸。
组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的 颗粒。 然后，经过转导将外源DNA克隆化，达到建库目的。
C、酵母人工染色体载体
酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes 简称YAC）， 是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必 需的端粒、着丝点和复制起始序列。酵母菌的复制原点，端粒， 着丝粒序列都已清楚，可用于完整真核基因的克隆。
重组DNA的产生
在正式连接反应之前，应通过理论实验确定载体、目的基因的最 佳用量比。
尽量使用新购-—转录形成的cDNA与适当的载体连接后转 化受体菌。这种包括特定组织细胞所有mRNA信息的cDNA插入的酶切位点。 替代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的
DNA片段可以被外源DNA取代。 替代型载体应用最广泛 如 λEMBL1-4是一类取代型载体系列
B．粘粒
质粒＋噬菌体
粘粒作为载体的特点是： 一般质粒的特性外还能装载大片段的外源DNA， 有可以识别噬菌体包装的“cos”位点。 包装时，只有能够达到所需片段的分子量标准的重
双链cDNA末端的处理
1、同聚物加尾法：利用小牛胸腺末端转移酶将dNTP添加到单链或双链DNA3' 羟基端的能力，将互补的同聚物分别加到载体与cDNA上，使二者相连。 2、接头法：将限制性核酸内切酶识别位点的接头（ｌｉｎｋｅｒ ln(1―f)
载体DNA的制备
1、载体DNA的酶切 限制性核酸内切酶部分消化 酶切是否完全 碱性磷酸酶去磷酸化处理后将其灭活
2、载体DNA的纯化 对粘粒载体：酚：氯仿混合物抽提或酒精沉淀法 对噬菌体载体：蔗糖密度梯度离心等。
基因组DNA克隆片段的制备
一、基因组DNA的提取 1、提取的DNA分子越长，酶切后产生的有效末端的片段数越多链接反应效率越高。 2、经典方法：在EDTA和SDS存在条件下，用蛋白酶K消化细胞刘姐物，然后用酚：氯 仿混合物抽提法除杂蛋白，再用透析法除低分子量杂质。 二、DNA克隆片段的制备 1、关键：将DNA切割成大小适中的随机片段。 常用方法：机械剪切法，限制性核酸内切酶消化法。（后者更常用、高效） 2、采取部分消化，通过控制限制性核酸内切酶的用量以及消化时间。 3、消化后分离只取长度适宜的片段。（蔗糖密度梯度离心法，琼脂糖凝胶电泳） 4、最好消化成35-45kb的片段，并用碱性磷酸酶处理。
f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA 大致相同，但个别或部分基因表达有差异 的不同组织提取mRNA，反转录合成cDNA后，在一定条件下用过量 的不含目的基因的一方作为驱动方（driver），与含有目的基因 的实验方（tester）进行杂交选择性去除两部分共同基因杂交产 生的复合物，多次重复杂交去除，将含有目的基因的一、核酸杂交法
1、用于核酸杂交的探针 （1）、同源探针：至少含有一部分与目的片段。部分同源探针： 用于探测与其序列相关但不同的克隆，其来源包括不同种属之间的相同基因 或同属某一基因家族的不同基因。 （2）、RNA探针：来源是对克隆在载体中的核酸片段进行体外转录获得。 （3）、寡核苷酸探针：通过明确的序列人工合成 2、菌落和空斑的原位杂交