紫外-可见分光光度计操作规程(TU1810)1．目的：制订本标准的目的是为规范检验人员在质量检验过程中的操作，保证检验结果的正确性。

2．适用范围：本标准适用于二厂检验员对产品质量的检验。

3．职责：QC检验员对本标准的实施负责。

4．程序：4.1 简述紫外-可见分光光度法是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收来进行分析的一种仪器分析方法。

这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。

朗伯—比耳定律（Lambert—Beer）是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。

当入射光波长一定时，溶液的吸光度是吸光物质的浓度及吸收介质厚度（吸收光程）的函数。

其常用表达式为，式中为系数：A=ε·ι·C式中A为吸光度；ε为吸收系数；C为溶液浓度；ι为光路长度。

如溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm，相应的吸光度即为吸收系数以E cm%11表示。

如溶液的浓度（C）的摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。

4.2 仪器紫外可见分光光度计是基于紫外可见分光光度法的原理工作的常规分析仪器。

根据光路设计的不同，紫外可见分光光度计可以分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。

4.2.1 仪器测量条件选择1.测量波长的选择通常都是选择最强吸收带的最大吸收波长λmax作为测量波长，称为最大吸收原则，以获得最高的分析灵敏度。

而且在λmax附近，吸光度随波长的变化一般较小，波长的稍许偏移引起吸光度的测量偏差较小，可得到较好的测定精密度。

但在测量高浓度组分时，宁可选用灵敏度低一些的吸收峰波长（ε较小）作为测量波长，以保证校正曲线有足够的线性范围。

如果λmax所处吸收峰太尖锐，则在满足分析灵敏度前提下，可选用灵敏度低一些的波长进行测量，以减少比耳定律的偏差。

2.适宜吸光度范围的选择任何光度计都有一定的测量误差，这是由于测量过程中光源的不稳定、读数的不准确或实验条件的偶然变动等因素造成的。

由于吸收定律中透射比T与浓度C是负对数的关系，从负对数的关系曲线可以看出，相同的透射比读数误差在不同的浓度范围中，所引起的浓度相对误差不同，当浓度较大或浓度较小时，相对误差都比较大。

因此，要选择适宜的吸光度范围进行测量，以降低测定结果的相对误差。

在实际工作中，可通过调节待测溶液的浓度或选用适当厚度的吸收池的方法，使测得的吸光度落在所要求的范围内。

3.仪器狭缝宽度的选择狭缝的宽度会直接影响到测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。

狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，势必要提高仪器的增益，随之而来的是仪器噪声增大，于测量不利。

选择狭缝宽度的方法是：测量吸光度随狭缝宽度的变化。

狭缝的宽度在一个范围内，吸光度是不变的，当狭缝宽度大到某一程度时，吸光度开始减小。

因此，在不减小吸光度时的最大狭缝宽度，即是所欲选取的合适的狭缝宽度。

4.3 紫外-可见分光光度计的检定4.3.1 波长示值误差与重复性仪器波长示值误差指标为±0.3nm，波长重复性指标为0.2nm，您可以用仪器氘灯的两条特征谱线检验，具体检验方法如下：①确认仪器光谱宽带为“2.0nm”。

开机初始化完成后，按数字5键进入系统应用界面，在系统应用界面中按数字键2强狭缝设定为“2.0nm”。

②在系统应用界面按RETURN键返回仪器主界面，按2键选择光谱测量功能。

③按F1键选择参数设定功能，按相应数字键设定采样间隔为0.2nm、扫描速度为中速、波长范围为660nm~480nm、纵坐标范围0-100、测光方式Es、光源选择氘灯④按RETURN键返回光谱扫描界面。

⑤按START/STOP键并输入增益值为6，按ENTER键确认，开始扫描。

⑥扫描结束后，按F2键并输入阈值（1~100）后，按ENTER键进行峰值检出（如果检出峰波长为0.000nm，则需要按键返回，然后重新按F2键输入比前次输入小的数值作为阈值，重新进行峰值检出）⑦按F4键打印输出重复扫描三次，并做峰值检出，氘灯的两个峰标准值为656.1nm和486.0nm。

4.3.2基线平直度样品池中不放任何遮挡物，以空气为空白进行测量，用波长扫描功能测量全波段的吸光度值，其具体测量方法如下①首先确认仪器光谱宽带为2.0nm②在仪器主界面俺2键选择光谱测量模式③按F1键进入参数设置界面，按相应的数字键设置测光方式Abs、采样间隔为1nm、扫描速度为中速、波长范围为1100~190nm、纵坐标范围为-0.01Abs~.0.01Abs④按RETURN键，返回光谱测量主界面，按AUTOZERO键进行基线校正。

⑤按START/STOP键进行扫描⑥按F4键打印输出。

读取曲线的吸光度值，在1090nm~200nm波长，测量扫描图谱中起始点与最大偏移之差即为仪器的基线平直度。

分光光度法允差范围测定透光率，应符合下表中规定。

4.4.1 计算分光光度法按《中国药典》规定，计算分光光度法一般不宜用于含量测定，对于少数采用计算分光光度法的品种，应严格按各品种项下规定的方法进行。

用本法时应注意：有一些吸光度是在待测成分吸收曲线的上升或下降陡坡处测定，影响精度的因素较多，故应仔细操作，尽量使供试品和对照品的测定条件一致。

若该品种不用对照品，如维生素A测定，则应在测定前对仪器作仔细的校正和检定。

4.4.2 比色法供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区。

用比色法测定时，由于显色是影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。

除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。

当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。

4.5 注意事项4.5.1 试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。

4.5.2 使用的石英吸收池必须洁净。

当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。

4.5.3 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。

装样品溶液的体积以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。

吸收池放人样品室时应注意每次放入方向相同。

使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干，防尘保存，吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3:1 v/v）混合液稍加浸泡后，洗净备用。

如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。

4.5.4 含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末瑞吸收。

因此，当作溶剂使用时，它们的范围均不能小于截止使用波长。

例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。

另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。

因此，在检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定吸光度，溶剂和吸收池的吸光度应符合下表规定。

以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定4.5.5 称量应按药典规定要求。

配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。

含量测定时供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份。

吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。

作鉴别或检查可取样品1份。

4.5.6 供试品溶液的浓度，除各品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸光度以在0.3~0.7之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制合适的读数浓度。

4.5.7 选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽的10%，否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供试品溶液的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外分光光法测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但当吸收带的半高宽小于20nm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查需用1nm缝宽或更窄，否则其264nm 的吸光度会偏低。

4.5.8 测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰±2nm 处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。

4.5.9 用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的pH 值是否一致，如pH 值对吸收有影响，则应调溶液的pH 值一致后再测定吸光度。

4.6 结果计算4.6.1 对照品比较法 可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。

C 样品=A 样品×C 对照/A 对照式中 A 为吸光度值；C 为测试液浓度（以mg/ml 计）。

4.6.2 吸收系数法 规定的吸收系数，系指E cm %11，即在指定波长时，光路长度为1cm ，试样浓度换算为1%（g/ml ）时的吸光度值，故应先求被测样品的E cm %11值，再与规定的E cm %11值比较，可计算出供试样品的含量。

E cm %11（样品）= LC A 式中 A 为供试品溶液测得的吸光度值；C 为供试品溶液的百分浓度，即100ml 中所含溶质的克数（g/ml ）；L 为吸收池的光路长度（cm ）。

供试品的含量%=（标准）样品%11%11)(cm cm E E ×100 式中E cm %11（样品）为根据前式计算出的供试品吸收系数； E cm %11（标准）为药典或药品标准中规定的吸收系数。

4.7 吸收系数测定法本法主要用于新品种的吸收系数测定。

4.7.1 测定方法 取精制样品精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度读数在0.6~0.8之间，置1cm 吸收池中，在规定波长处按5.5.8项的规定测出吸光度读数，然后再用同批溶剂将溶液稀释1倍，使吸光度在0.3~0.4之间，再按上述方法测定。

样品应同时测定2份，同一台仪器测定的2份结果，对平均值的偏差应不超过±0.3%，否则应重新测定。