ISS N　100727626 C N　1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年10月21(5):691～694・技术与方法・双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法翁　瑜1),2),　曾群力2),3),　姜　槐2),　许正平2),3)3(1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州　310031)摘要　组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.关键词　蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化中图分类号　Q503Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2Dimensional E lectrophoresisWE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3(1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics,Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou　310031,China)Abstract　Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE.K ey w ords　protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助3联系人　T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006)3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@ 双向凝胶电泳(tw o2dimensional electrophoresis,22 DE)是蛋白质组学研究中分离蛋白质的主要技术之一[1],其原理是根据蛋白质等电点的不同在pH梯度胶内进行第一向等电聚焦分离,然后根据蛋白质的相对分子量大小利用聚丙烯酰胺凝胶进行第二向分离,经染色后得到二维的蛋白质分布图谱.双向凝胶电泳高分辨率分离蛋白质的关键是组织或细胞样品的制备,即蛋白质的提取.蛋白质提取一般使用含变性剂、表面活性剂和还原剂等成分的裂解液.其中,变性剂如尿素使蛋白质变性并使蛋白质水解酶失活;表面活性剂如CH APS促进蛋白质溶解;还原剂如DTT使蛋白质内的二硫键处于还原状态,有利于蛋白质的溶解.然而,目前的蛋白质样品制备方法存在着一些缺陷:①获得的样品中往往含有干扰物质,如盐离子、核酸、脂类和多糖等,从而引起蛋白质电泳行为的变化,其后果是不仅在一向电泳中干扰蛋白质的等电聚焦,而且会影响二向中蛋白质的迁移[2].②由于蛋白质溶解性的不同,约占细胞蛋白总量30%的膜蛋白在常用裂解液中很难溶解,导致二向图谱上出现的主要是可溶性蛋白质[3].③常用裂解液抽提方法步骤多、耗时长,容易引起蛋白质丢失和降解.因此,为适应不同组织或细胞的特殊理化性质,需要针对不同来源的样品进行蛋白质提取条件的优化,以获得足够量、高纯度的蛋白质样品用于后续实验.本实验以人乳腺癌细胞株MCF27为对象,比较了3种不同的蛋白质提取方法包括Pierce公司的哺乳动物蛋白抽提试剂M2PER、标准裂解液和添加硫脲的裂解液对22DE结果的影响,了解不同裂解液的提取效率以及它们与双向凝胶电泳条件的兼容性,从而建立了MCF27细胞总蛋白的相对最佳提取方法.1　材料与方法111　材料人乳腺癌细胞株MCF27购自AT CC公司(Number:HT B222)胎牛血清和改良型Eagle培养基(Dulbeccoπs m odified Eagleπs medium,DME M)购自Hyclone公司,胰酶为Invitrogen公司产品,固相pH梯度胶条、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、CH APS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和尿素等购自Bio2Rad公司,M2PER试剂为Pierce公司产品,硫脲购自Sigma公司,牛血清白蛋白为生物工程公司产品.细胞培养箱是F orma公司产品,分光光度计(SmartS pecT M3000spectrophotometer)、双向电泳设备(一向是PROTE AN IEF cell,二向是PROTE AN Plus D odeca Cell)和G S2800扫描仪是Bio2Rad公司的产品,超声波细胞粉碎仪购自宁波新芝科器研究所,低温高速离心机和混合器由E ppendorf公司生产.112　细胞培养　MCF27细胞接种于含10%胎牛血清的DME M 新鲜培养基中,37℃常规培养于含5%湿润C O2的细胞培养箱里.待单细胞层近汇合时,胰酶消化,并以3×104细胞Πcm2的密度接种于直径为100mm的3个细胞培养皿(ORANGE,US A)中.24h换液后,继续培养24h提取蛋白质(此时每皿细胞数为1×107个).113　蛋白质提取M2PER试剂法:弃去皿中的旧培养基,用预冷的P BS洗细胞2次,加入M2PER试剂(500μl每107细胞),在冰上静置裂解5min后,迅速用刮棒刮下细胞,并收集到115ml离心管中.4℃、12000g离心8min后,取上清储存于-70℃备用.标准裂解法:离心收集胰酶消化的细胞后,用预冷的P BS洗细胞2次,然后每1×107细胞加1ml裂解液(8m olΠL尿素,4%CH APS,现加65mm olΠL DTT 和012%(WΠV)Bio2Lyte,pH3～10),放于冰上静置裂解30min,再超声(180～200W,每次工作10s,间隔10s,共20次),最后以4℃,20000rΠmin离心1h,取上清储存于-70℃备用.硫脲裂解法:离心收集到的细胞经预冷的P BS 洗2次后,在1×107个细胞中加含硫脲裂解液(7 m olΠL尿素,2m olΠL硫脲,4%CH APS,现加65mm olΠL DTT和012%(WΠV)Bio2Lyte,pH3～10)约1ml.后续步骤同标准裂解法.114　蛋白质定量参考文献[4]采用Bradford法定量,以牛血清白蛋白为标准蛋白.115　双向凝胶电泳取含250μg蛋白质的上述蛋白质提取液,用上样水化缓冲液(7m olΠL尿素,2m olΠL硫脲,4% CH APS,65mm olΠL DTT,012%(WΠV)Bio2Lyte,pH3～10,01001%溴酚蓝)补充体积到300μl后,将17cm、pH4～7的固相pH梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶液上方,被动水化12h,然后进行等电聚焦(17℃, 250V,30min;1000V,3h;10000V,5h;10000V, 60000Vh).聚焦结束后,分别用含2%DTT和215%296中国生物化学与分子生物学报21卷碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液(6m olΠL尿素,2% S DS,01375m olΠL T ris2Cl pH818,20%甘油)平衡胶条各15min.DTT是为了还原蛋白质的二硫键,而碘乙酰胺是为了去除多余的DTT.平衡完毕后,将胶条紧贴在12%的聚丙烯酰胺凝胶上方,进行第二向电泳(恒压200V,615～7h).电泳结束后采用改进的银染方法对凝胶进行染色[4],然后用Bio2Rad的G S2800扫描仪扫描图像,所获图象用PDQuest711分析软件进行分析.实验重复3次.2　结果211　蛋白质定量M2PER试剂法提取的总蛋白浓度为41018 mgΠml,体积为015ml,总蛋白量为21009mg;标准裂解法提取的总蛋白浓度为31762mgΠml,体积为1 ml,总蛋白量为31762mg;硫脲裂解法提取的总蛋白浓度是315mgΠml,体积为1ml,总蛋白量为315mg.从以上结果可以看出,Pierce试剂提取的蛋白量与两种裂解液相比有较大差距,蛋白质提取效率没有后两种方法好.212　双向凝胶电泳所检测蛋白质的数量利用PDQuest软件自动统计22DE图谱上的蛋白质斑点数量.蛋白质斑点选定标准是:斑点个体独立,形态明显,3次实验重复出现.结果显示:M2PER 试剂法胶上蛋白点平均有1350±12个,标准裂解法胶上蛋白点平均为1326±10个,硫脲裂解法胶上的蛋白点平均为1368±9个.以上结果说明3种提取方法对蛋白质的检出数量影响不大.213　双向凝胶电泳图谱上蛋白质的分布Fig11A显示,M2PER试剂法得到的双向电泳图谱横纹多而明显,高丰度的蛋白点区域分辨率偏低(椭圆1区域),高分子量蛋白点(方框2区域)分离效果较差,独立蛋白点少.但在分子量为15～70kD、pH417～613的范围内(方框3所示),M2PER试剂法提呈的蛋白点多而集中,并存在很多只在本法中清楚显现的点,如箭头所指的椭圆区域4、5和6,说明该法适于提取偏酸性的70kD以下蛋白质.标准裂解法的图谱(Fig11B)横纹较少,高丰度 Fig.1　S ilver stained gel of tw o dimensional electrophoresisThe proteins were separated in the pI range between417and619,and m olecular weight between15kD and130kD (A)Proteins were extracted by using Pierce M2PER kit;(B)Proteins were extracted by using standard lysis bu ffer;(C)Proteins were extracted by using im proved lysis bu ffer蛋白点区域的分辨率比M2PER试剂法有所提高,蛋白点个体独立,形态清楚,同时蛋白质分布更广.在高分子量区域(>70kD),蛋白点分离效果明显增强,显现了一些新蛋白点,如箭头所指区域7,但在分子量为15～70kD、pH417～613的区域中蛋白点比M2PER法少.硫脲裂解法的图谱(Fig11C)与标准裂解法分布基本相似,但横纹是三者中最少的,且高丰度蛋白点396第5期翁　瑜等:双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法　分离非常清楚,高分子量蛋白点(>70kD)分布除了区域7还扩展到箭头所指的区域8.从图谱上可见,相同的蛋白点在本法中的圆而大,即单个蛋白丰度增高,如箭头9和10所指.3　讨论从双向电泳图谱看,标准裂解法在高分子量区域的分辨率比M2PER试剂法有所提高,含硫脲裂解液对蛋白质的溶解性比标准裂解液强,所分离的蛋白点更多,形态更好,横纹相对更少,图谱分辨率更高.因此,我们认为硫脲裂解液更适合于MCF27细胞的蛋白质提取.但不足的是,硫脲裂解法和标准裂解法提取蛋白的步骤相对较多、耗时较长,可能会引起蛋白的降解.M2PER试剂法在提取分子量为15～70kD、pH417～613的蛋白质方面具有明显的优势,而且提取过程相对简单、方便、快速,有利于减少蛋白降解.但是,该法的蛋白提取量相对较少,难以获得高分子量蛋白,且可能由于盐离子等杂质较多,导致双向图谱中出现明显横纹,因此需要在双向凝胶电泳前对蛋白样品进行纯化.硫脲裂解液适合于提取双向凝胶电泳用蛋白质样品的原因是联合使用了硫脲、尿素和CH APS.研究表明,硫脲是高效率的变性剂,能溶于高浓度的尿素溶液,从而改善疏水性膜蛋白的溶解性[5].同时,硫脲和尿素联用能提高蛋白质在固相pH梯度胶条的溶解度[5,6].实验中使用的表面活性剂CH APS是兼性分子,不带净电荷,也溶解于高浓度的尿素溶液,从而进一步提高了蛋白质的溶解性.本法中采用DTT还原蛋白质中的二硫键,浓度为65mm olΠL,符合文献所推荐的浓度范围[2].虽然一些文献也报道不带电荷的还原剂T BP可以提高等电聚焦过程中蛋白质的溶解性,并有利于蛋白向S DS2PAGE胶的转移[5],但我们发现本实验中DTT和T BP对溶解性的影响并无显著差异.在蛋白质提取过程中,可以采用商品化的纯化试剂盒如Bio2Rad公司的clean2up试剂盒去除样品中少量的核酸、盐离子、脂类等干扰后续电泳的物质.我们在实验中也曾用它进行蛋白质纯化,但据我们观察,该试剂盒的纯化效率与样品来源相关,所以蛋白质纯化方法的选择仍需根据具体的实验进行摸索.我们认为,3种方法中以含硫脲的裂解液相对最适合MCF27细胞的蛋白质提取,与双向凝胶电泳条件的兼容性更好.参考文献(R eferences)1　S tanley B A,Neverova I,Brown H A,Van Eyk J E.Optim izing protein s olubility for tw o2dimensional gel electrophoresis analysis of human my ocardium.Proteomics,2003,3(6):815～8202　Shaw M M,Riederer B M.Sam ple preparation for tw o2dimensional gel electrophoresis.Proteomics,2003,3(8):1408～14173　Santoni V,M olloy M,Rabilloud T.M embrane proteins and proteom ics: un am our im possible?Electrophoresis,2000,21(6):1054～10704　Ausubel F M,Brent R,K ingston R E,等著.颜子颖等译.精编分子生物学实验指南,第3版.北京:科学出版社,1999:332,361～363(Ausubel F M,Brent R,K ingston R E,et al.Short Protocols in Molecular Biology,3rd A:J W iley,1995)5　Herbert B.Advances in protein s olubilisation for tw o2dimensional electrophoresis.Electrophoresis,1999,20(4～5):660～6636　Rabilloud T,Adessi C,G iraudel A,Lunardi 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