文章编号:1001-7658(2004)10-0293-04=论著>含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法的研究王炜红 陈微娜 葛 洪 侯延文 林 玲 宋长江(黑龙江省疾病预防控制中心,哈尔滨 150036)提要 为研究含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法,依照2002年版5消毒技术规范6规定的试验程序进行了实验室观察。
结果,含有效氯800mg/L 的次氯酸钠、10mg/L 的优氯净和50mg/L 二氧化氯对Vero 细胞生存率无影响;用0.01mol/L PBS 配制的5g/L 硫代硫酸钠中和剂对Vero 细胞生存率无影响。
用含5g/L 硫代硫酸钠中和剂对含有效氯400mg/L 的次氯酸钠设计的6组中和剂鉴定试验,结果符合设计要求。
用该方法检测证明,以含有效氯400mg/L 次氯酸钠消毒剂,作用30min,对脊髓灰质炎病毒平均灭活对数值\4.0。
试验发现,0.03mol/L 的PBS 、卵磷脂以及吐温80对Vero 细胞生存率均有影响。
关键词 脊髓灰质炎病毒;中和剂;有效氯;灭活试验中图分类号:R187.2 文献标识码:ASTUDY ON TEST METHOD FOR INAC TIVATION OF POLIOVIRUS BY C HLOR INE -C ONTAIN -ING DISINFECTANTSWANG Wei -hong,C HE N Wei -na,GE Hong ,HOU Yan -wen,LIN Ling ,SO NG Chang -jiang(Heilongjian g Provincial Center for Disease Prevention and Con trol,Harbin 150036,China)Abstract In order to study the test method for inactivation of poliovirus by chlorine-containing disinfectants,laboratory obser -vation was carried out according to the test procedures specified in 5Disinfection T echnical Guidelines 6,2002ed.The results showed that sodiu m hypochlochlorite containing available chlorine 800mg/L,10mg/L You-L -Ji ng ,50mg/L chlorine diox ide and 5g/L sodi um thiosulfate neutralizer reconsti tuted with 0.01mol/L PBS had no influence on survival rate of Vero cells.The results of neu tralizer identification test,in which 6groups were designed using 5g/L sodium thiosulfate as the neutralizer for 400mg/L sodiu m hypochlori te disinfectant,fulfilled the requirement of ing this method,it was proved that sodium hypochlori te containi ng available chlorine 400mg/L with a 30min con tact time could inactivate polivirus wi th an average inacti va -tion logarithm \4.0.It was found by test that 0.03mg/L PBS,lecithin and tween 80had influence on survival rate of Vero cells.Key words p oliovirus ;neutralizer ;available chlorine;inactivation test1作者简介2 王炜红(1958-),女,黑龙江哈尔滨市人,大学,副主任医师,从事病毒防治、消毒学及医院感染控制工作。
2002年版5消毒技术规范6采用脊髓灰质炎病毒1型疫苗株作为病毒灭活试验代表,并规定了相应的试验方法。
脊髓灰质炎病毒属无包膜小RNA 病毒,对外界理化因子抗力比较强,培养制备方法比较简单,在很多细胞内均可生长,用其作为评价消毒理化因子灭活指标国内外都有应用11,22。
但在体外灭活试验中,很多试剂对细胞生长有不同程度的毒性,如消毒试验中的消毒剂、中和剂及稀释液等,给试验带来一定的困难。
为了科学评价消毒剂对该病毒的灭活效果,依据5消毒技术规范6规定的试验程序,以含氯消毒剂为对象,在实验室研究了脊髓灰质炎病毒的灭活试验方法。
现将结果报告如下。
1 方法1.1病毒滴定方法用Vero 细胞培养制备的脊髓灰质炎病毒1型疫苗株(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)悬液,再用细胞维持液进行10倍系列稀释,每个稀释度接种(96孔培养板)4孔,置于37e 二氧化碳培养箱内培养。
逐日观察结果,连续观察5d,记录细胞病变情况,计算半数细胞感染剂量(TCID 50)。
1.2中和剂鉴定试验1321.2.1预备试验 分别测定消毒剂、中和剂、中和产物对细胞生长的影响。
¹取次氯酸钠、优氯净和二氧化氯系列稀释液,分别接种于已经形成单层细胞#293#中国消毒学杂志2004年第21卷第4期的培养板上,吸附2h,更换维持液,置于37e 二氧化碳培养箱内培养。
º分别取5g/L 硫代硫酸钠的PBS 和含5g/L 硫代硫酸钠+10g/L 吐温80+1g/L 卵磷脂的PBS 的系列稀释液,分别接种单层细胞培养。
»将800mg/L 二氧化氯消毒剂与º中的两种中和剂以1:9比例配制成中和产物,接种单层细胞培养。
1.2.2正式鉴定试验 依照5消毒技术规范62.1.1.10条款规定的程序,设计6组试验(表3),对400mg/L 有效氯的次氯酸钠消毒剂作中和剂鉴定试验。
1.3病毒灭活试验取保存的脊髓灰质炎病毒悬液100L l 与3%小牛血清白蛋白100L l 混合,置于19~21e 水浴恒温5min,加入800L l 消毒剂混合均匀。
作用30min,取出0.1ml 加到0.9ml 中和剂小试管内,中和作用10min 。
取中和后样液接种细胞,连同阳性对照和阴性对照一并培养,观察并记录细胞病变情况,计算半数细胞感染剂量(TCID 50)。
2结果2.1中和剂鉴定预备试验结果2.1.1消毒剂对细胞生长的影响结果 含有效氯800mg/L 次氯酸钠、10mg/L 优氯净和50mg/L 二氧化氯对细胞生长均无影响;高于上述浓度均有影响(表1)。
表1三种含氯消毒剂对细胞生长率的影响Table 1Influence of 3chlorine -containing disinfectants ongrowth rate o f cells消毒剂名称Disi nfec tant 有效氯含量(mg/L)/细胞生存率(%)Available chlorine content (mg/L)/survival rate of cells (%)次氯酸钠Sodium hypo- c hlorite 2000/0.001000/0.00800/100.00600/100.00优氯净Yon-Lu- Jing 40/0.0030/0.0020/62.5010/100.00二氧化氯Chl orine dioxi de200/0.00150/0.00100/62.5050/100.00注:阴性对照细胞生长正常。
试验重复3次。
Note:The negative control cells gre w normally.The tes t was triplicated.2.1.2中和剂对细胞生长的影响结果 在5g/L 硫代硫酸钠中加入吐温80和卵磷脂对细胞生长有明显影响;0.03mol/L 磷酸盐缓冲液亦影响细胞生长,但0.01mol/L 则无影响。
用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液配制的5g/L 硫代硫酸钠中和剂对细胞生长无影响。
2.1.3中和产物对细胞生长的影响结果 用800mg/L 二氧化氯和400mg/L 次氯酸钠与5g/L 硫代硫酸钠的PBS(0.01mol/L)以1:9比例配制的中和产物对细胞生长均无影响(表2)。
表2中和产物对细胞生长影响试验结果Table 2Results of test for influence o f neutralizing product oncell growth消毒剂Disinfectant 中和剂组成Netralizer稀释比例Dilution 细胞平均生存率Average s urvi val rate of cells(%)二氧化氯5g/L 硫代硫酸钠原液100.00Chlorine 5g/L sodium thiosulfate1B 2100.00di oxide二氧化氯5g/L 硫代硫酸钠+10原液0.00Chlorine g/L 吐温80+1g/L 1B 225.00 di oxide卵磷脂1B 4100.005g/L sodium thiosulfate +10g/L t ween 80+ 1g/L lecithi n次氯酸钠5g/L 硫代硫酸钠+原液100.00Sodium 0.01mol/L PBS 1B 2100.00hypoch-5g/L sodium thiosulfatelori te注:试验重复3次。
Note:The tes t was triplicated.2.2中和剂鉴定试验结果按预备试验确定的条件,采用6组试验方案和判断标准,用0.01mol/L PB S 配制的含5g/L 硫代硫酸钠溶液可有效中和含有效氯400mg/L 的次氯酸钠,中和剂及中和产物均对培养细胞无影响(表3)。
表3次氯酸钠中和剂试验结果Table 3Results of sodium hypochlorite neutralizer test组 别Group各次试验病毒滴度(TCID 50)对数值(log)Logari thm (log)of vi rus titer (TCID 50)in each test平均值Average1231 1.50 1.17 1.83 1.5020.500.670.830.673 5.50 5.50 5.50 5.504 4.50 5.23 4.50 4.7455.505.675.835.67 注:第6组细胞生长正常。