通过扩增青霉素生物合成基因簇 提高产黄青霉在固态和液态发酵中的
青霉素产量 第二组 World J Microbiol Biotechnol (2008)
青霉素 杀菌
影响青霉素产量高低
次级代谢
随机突变
优化
基因工程
结构基因(pcbAB, pcbC和penDE) 基因过表达
构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
结果与讨论
• 这与实验结果相符，菌株Wis 54-1255比P2-32 更接近于野生型，其由于额外拷贝的转入而导致 的在固态发酵中产量的增加比P2-32更高。相反 地，对于菌株P2-32，额外拷贝的转入则在液态 发酵中起到更加显著的作用。显然，在Wis中更 加保守的“固态培养基因”促进了其新的生物合 成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株 P2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验结 果也可用相同的原理来解释，那就是Wis在固态 发酵和液态发酵（培养系统）间产量水平的差别 在TW转化株上更加显著，而这种差别在P2转化 株上则较小。
结果与讨论
• 如前所述，P2-32转化株在液态发酵和固态发酵中均比 Wis 54-1255转化株显示出更高的青霉素产量的增加（相 比于其亲本菌株）。对这些结果有种与生物合成基因无关 的解释。P2是一个不断经过突变和筛选而得的高青霉素产 量菌株。这意味着它已经积累了很多突变，而很多这些突 变在功能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因）， 比如更高的输出能力。很多这类基因已被描述（Kiel et al. 2005; Lamas-Maceiras et al. 2006; Garcı´a-Rico et al. 2008）。这些突变使得更高的青霉素生物合成潜能得到 更好地表达（由于生物合成基因的扩增）。因此，已存在 于菌株P2中的互补突变必定使得菌株对通过增加青霉素基 因簇拷贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高效的利 用。
转化菌株 的菌丝体
接种了枯草芽孢杆 菌的胰蛋白胨 （1%琼脂）培养 基中
材料和方法
液态发酵
接种 （1×106）
取各菌株的孢子
每隔一定时间，取5毫升培养物
转接
作为副本
含有50ml复合 生长培养基 25oC, 50rpm
培养36小时
含有45ml复合 生产培养基
25oC,
250rp m培 养144 小时
材料和方法
固态发酵
经过0.3-0.6mm孔径筛过的甘蔗渣 改良的Somerson复合生产培养基
接种（ 2×106孢子/ml ）
初始的水分含量设定为70%
在每个Raimbault型圆柱发酵罐中加入12g固体培养基
25 oC条件下进行144小时，通气量设定为2.4L/h
取1克潮湿的培养 基样品测定其pH 值和青霉素含量
材料和方法
菌株
• 产黄青霉Wis54-1255——青霉素低产菌株 • 产黄青霉Wis54-1255 npe10——其青霉素基因簇不完整 • 产黄青霉P2-32——青霉素高产菌株 可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍 • 产黄青霉CC 6633——用于在生物测定中评估青霉
结果与讨论
• 转化菌株Wis54-1255和P2-32被转移至腐草霉素浓度不断 增高的琼脂培养基上，以便选出含有高拷贝数的选择标记 基因ble的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌 株。转化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有 60μg/ml腐草霉素添加剂的培养基上生长。
• 利用整套基因簇来增加青霉素基因的拷贝数而不 是转入单个的pcbAB和pcbC-penDE基因。
• 为实现这一目标，用分别位于基因簇的两个末克隆证实这两个探针都已分离 出来并获得了粘性质粒DNA。
结果与讨论
• 以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行 Southern分析，分析中仍然使用相同的两个探针 以确定它们包含整套的青霉素基因簇。其中一个 名为IztapaCos-pen5的粘性质粒（图2 第5列）， 被用于转化产黄青霉。
结果与讨论
• 另外，本实验首次显示基因剂量的增加对固态发 酵中次级代谢物产量的提高也同样适用。在这点 上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的 形式下，也可用于其它更适用于固态发酵的实验， 如Barrios-Gonza´lez et al. (1993a)和Ban˜os et al. (2007)描述的那些。
整个的 基因簇 pcbAB– pcbC– penDE
产黄青霉（Penicillium chrysogenum）
上述研究均是利用产黄青霉Wis54-1255完成的， Wis54-1255仅含有一个青霉素基因簇的拷贝并且只能 产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于液态发酵。
本实验中，研究者对比了在转入整个青霉素基因簇后 低产菌株（Wis54-1255）和高产菌株（P2-32）青霉 素产量的差别，并且首次应用此法检测转化菌株在新 兴的固态发酵（SSF）技术（Suryanarayan 2003; Barrios-Gonza´lezand Mejı´a 2007）中的反应。
• 对原始和转化菌株的青霉素产量采用 Student’s T-test方法进行分析。
结果与讨论
• 在粘性质粒载体Izt入真菌之中，不需进一步的亚克隆。
• 首要目标——分离出一个含有整套青霉素基因簇 的粘性质粒克隆。
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追求至善凭技术开拓市场，凭管理增 创效益 ，凭服 务树立 形象。2020年10月20日星期 二上午12时40分32秒00:40:3220.10.20
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• 综上，本试验结果表明，不论对低产或高产的菌 株，尽管后者已经含有高拷贝的青霉素基因簇，
扩增青霉素基因pcbAB-pcbC-penDE的数量均会
使菌株在液态发酵和固态发酵中的产量得到提高。
小组成员
• 组长：陈静 • 第一篇文献翻译：张蕊、邢跃、张倩、张
晶 • 第二篇文献翻译：周建平、郝雅男、陈静、
素G的产量 和方法
质粒载体
IztapaCos
cos区 多克隆位点
腐草霉素抗性基因位点 （基因ble）——作为 真菌选择标记 删除PstI和XbaI的限制 性
全部DNA
提取
Sau3A1部分消化 去磷酸化
连接
IztapaCos 载体
BamHIXb 副本
于暗盒中在 -70oC条件 下用 HiperfilmMP胶片曝 光1小时
【通过PCR方法获得】 以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT 和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG 为引物，
• 同时利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素 产量。检测中青霉素产量最高的菌株是对60μg/ml腐草霉 素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉 素产量最高的转化菌株分别命名为TW和TP。
• 对液态发酵和固态发酵中TW和TP菌株的青霉素产量作了 仔细检测，并在同一实验中与其亲本菌株的发酵产量作了 比较。在亲本菌株内转入IztapaCos（空载体）作为对照， 该转化菌株的青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。
并包括基因pcbAB编码区的3’末端序列 和3’-UTR的起始序列
pbcAB探针
通过切口转移标记上α-32P-dCTP
penDE探针
【由HindIII酶切质粒pULJL33而获得】 大小为0.3kb ，包含基因penDE的3’ 末端序列
材料和方法
真菌的转化
碱裂解
E.coli
40kbp粘性质粒
30μg/ml 腐草霉素
取出并混匀圆形容器中的内容物
1700rpm离心20分钟，青霉素被抽提到0.1M的磷酸缓冲液中 从值而）使。样 取品60的微p升H提值取为物5.或5（其如稀果释有物必用要于可生加物入鉴H定3P。O4调节pH
材料和方法
数据分析
• 对于固态和液态发酵实验，实验结果为两 个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶 或圆柱发酵罐）为一式三份。
结果与讨论
• 相对于亲本菌株，转化菌株TW和TP的青霉素产量在两种 培养体系中均有显著提高。然而，来源于菌株P2-32的转 化菌株TP的青霉素产量则提高的更多。
结果与讨论
• 关于产黄青霉( P. chrysogenum )青霉素产量的早期研究表
明微生物在固态发酵中的生理生化反应与在液态发酵中的大 不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。 这一信息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方 法的必要性（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a; BarriosGonza´lez and Mejı´a 2007）。研究表明越接近于野生型的 菌株在固态发酵能越高效地发挥其青霉素生产潜力，这说明 在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株， 正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应 和生长的重要功能，（Barrios-Gonza´lez et al.1993a）。 寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已 成为当前研究的主题（Barrios-Gonza´lez et al. 2008; Ishida et al. 2000; Te Biesebeke et al. 2005）。
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加强交通建设管理，确保工程建设质 量。00:40:3200:40:3200:40Tuesday, October 20, 2020
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安全在于心细，事故出在麻痹。20.10.2020.10.2000:40:3200:40:32October 20, 2020
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