重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。
方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。
结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。
结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
【关键词】HER2; 真核表达; 转染［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.［Keywords］HER2 ; eukaryotic expression; transfection人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptors, HER2)属于表皮细胞生长因子受体(EGFR)家族成员, 是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的单链跨膜糖蛋白, 相对分子质量(Mr)为185 000。
HER2作为跨膜蛋白, 由胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)三部分组成。
ECD主要是由两个配体结合区(RLD) 与两个富含半胱氨酸区构成［1］。
HER2 RLD可与EGFR受体家族的其他成员及配体形成复合物, 参与细胞增殖信号的转导［2］。
HER2 基因主要是在人体的胚胎发育时期表达, 它参与多种组织器官的生长发育, 而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在, 表达水平较低; 研究表明, HER2 基因异常扩增或过表达与多种肿瘤的发生、发展及预后有密切相关, 其中以乳腺癌最为密切, 已成为乳腺癌复发、患者生存期判断的一个独立指标［3］。
研究显示, HER2 ECD阳性乳腺癌患者对内分泌治疗及化疗的反应性降低、预后差、肿瘤呈进行性生长、总生存和无疾病生存期短及肿瘤复发率高［4］。
因此, 构建重组HER2表达载体并获得稳定转染乳腺癌细胞株可为深入研究HER2基因过表达与乳腺癌的关系及其基因治疗奠定基础。
由于全长HER2 基因有导致正常细胞转化的潜在风险, 而且, 其胞内区具有激酶活性的结构域与其他激酶有较高的同源性［5］。
因此, 本研究我们选取HER2 的ECD构建真核表达质粒（pcDNA6/v5 his HER2）; 将其转入HER2阴性的小鼠乳腺癌细胞(EMT6)中, 以获得稳定表达HER2 ECD的EMT6细胞株（EMT6/HER2）。
1 材料和方法1.1 材料带有HER2全长基因的重组质粒（pcDNA3.1HER2）由北京医药技术研究所林亚军博士惠赠; EMT6细胞购自第四军医大学实验动物研究中心。
PCR试剂购自上海生工公司; 质粒pcDNA6/v5 his、TRIzol 及杀稻瘟菌素(Blasticidin)购自Invitrogen公司; AMV反转录酶购自Promega公司; DL 2 000 DNA marker购自TaKaRa; T4 DNA 连接酶、Hind Ⅲ和Nhe Ⅰ内切酶购自Fermentas。
质粒小提试剂盒购自TIANGEN; RPMI1640完全培养基购自Gbico公司; 胎牛血清购自杭州四季青; 胰酶购自Amersco; 多聚乙烯酰胺(PEI)购自Sigma公司; HER2检测免疫组化广谱试剂盒购自迈新生物技术公司。
1.2 方法1.2.1 HER2 ECD基因的扩增以GenBank中NM_004448的ORIGIN为参考序列设计引物, 引物序列上游: 5′ctaaccatggagctggcggccttgt3′（起自第237 bp）, 下游: 5′ccatcaactgcacccacggg3′(第2 133 bp终止), 上下游引物5′端分别加入Hind Ⅲ和NheⅠ酶切位点。
拟扩增的HER2胞外区长度为1 896 bp, 加酶切位点后产物总长度为1 914 bp。
以pcDNA3.1 HER2为模板进行PCR扩增。
反应循环参数: 94℃5 min, 94℃1 min, 62℃1 min, 72℃1 min, 30个循环, 72℃延伸10 min。
1.2.2 pcDNA6/v5his HER2的构建回收并纯化PCR 产物; 用Nhe I和Hind Ⅲ分别对PCR产物、pcDNA6/v5his进行双酶切、纯化; T4 DNA连接酶16℃水浴过夜连接; 连接产物转化DH5α感受态细菌, 并于含50 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基37℃培养过夜; 挑取阳性克隆, 扩大培养, 按质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒; 用PCR、双酶切对重组质粒进行鉴定无误后, 送TaKaRa公司测序。
1.2.3 pcDNA6/v5hisHER2转染EMT6细胞分别以pcDNA6/v5his HER2（实验组）及pcDNA6/v5 his（空质粒对照组）用PEI法转染EMT6细胞, 以未转染正常EMT6细胞作为空白组。
转染方法参照文献［6］进行。
1.2.4 EMT6细胞中HER2 mRNA的检测用TRIzol RNA提取试剂盒, 分别提取正常EMT6、对照组和实验组抗性细胞中的总RNA, 溶于DEPC水。
用HER2 ECD的上下游引物进行PCR扩增。
扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 HER2在EMT6中表达产物检测(1)细胞爬片制备: 用胰酶消化抗性克隆细胞, 将无菌洁净的盖玻片放入培养瓶中, 加入适量培养液, 待细胞达90%汇合时, 取出盖玻片; 用100 g/L甲醛固定30 min, 置-20℃保存。
(2)用免疫组化方法检测细胞中HER2基因的表达, 具体参照试剂盒说明书。
2 结果2.1 HER2胞外区基因的PCR扩增以pcDNA3.1HER2为模板, 用PCR扩增HER2 ECD基因, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, PCR产物为长度为1 896 bp, 与预期PCR产物大小一致（图1）。
2.2 pcDNA6/v5his HER2 的鉴定pcDNA6/v5his HER2转化DH5α宿主菌后获得大量阳性克隆, 分别用菌液PCR、双酶切及测序对重组克隆进行鉴定。
(1)随机挑取8个菌落于ALB液体培养中扩增; 做菌液PCR初步鉴定, 获得预期的结果（图2）。
(2)将阳性菌落扩增后行质粒小提, 用Hind Ⅲ和NheⅠ进行双酶切, 电泳结果显示, 标本1切出与PCR产物大小一致的片段（3、5可能为不完全酶切, 图3）。
⑶标本1送TaKaRa公司测序, 结果显示pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确。
2.3 质粒转染和克隆筛选转染细胞经Blasticidin (终浓度为10 mg/L)持续筛选10 d后可观察到单克隆形成, 再以含维持量的Blasticidin(终浓度为2 mg/L)培养液进行克隆扩增, 得到EMT6/HER2（实验组）和EMT6/pcDNA6/v5 his(对照组）两种细胞株。