二、技术路线的设计
总技术路线： 核酸的释放



核酸的分离、纯化(包括粗分离和细分离)
核酸的浓缩、沉淀与洗涤 核酸的鉴定与保存
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放


（一）核酸的释放
分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态和生物活性。

核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
浓度测定方法： 10ul DNA+990ul双蒸水，测A260值。 记录A值，通过计算确定DNA浓度， 公式如下: dsDNAg/ml=50×A260 × 稀释倍数
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
第五章 核酸的分离与纯化
生物大分子分离纯化设计总原则
应遵循的总原则： 一是保持生物大分子序列的完整性 二是保证生物大分子制品的纯度

核酸分离纯化的设计及原则
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
应遵循的原则： 一是保持核酸序列的完整性 这是是结构 研究和基因诊断的基本要求。通常要求得 到的片段的长度不小于100-200kb。 二是保证核酸制品的纯度 尽量排除其它 分子对后续研究的干扰。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
（四）核酸的鉴定与保存
核酸的鉴定： 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定

核酸分离纯化的设计及原则—技术度法： 由于嘌呤碱和嘧啶碱具 有共轭双键结构，具有 独特的紫外线吸收光谱， 一般在260nm左右有最大 吸收峰，可以作为核酸 及其组份定性和定量测 定的依据。检测灵敏度 0.25ug/ml（250ng/ml）。
核酸分离纯化的设计及原则—材料与方法选择
一、材料与方法的选择
（一）材料与方法的选择 可选择的生物标本：体液（血液、尿液、唾液、痰 液、胸腹水）、组织块、培养细胞等。

可选择的分离方法：酚抽提法、甲酰胺解聚法；异 硫氰酸胍-酚-氯仿法等。 方法选择原则：在满足研究或检测对核酸完整性和 纯度要求前提下，尽可能考虑核酸制备的时间、成 本、实验室安全性。



分离对象的基本情况
核酸存在形式 核蛋白(nucleoprotein) DNA + 蛋白质（deoxyribonucleoprotein, DNP ） RNA + 蛋白质（ribonucleoprotein, RNP ） 核酸的细胞定位、结构 真核生物核酸的分布： 核内染色体DNA、细胞器DNA；细胞质RNA 原核生物核酸的分布： “染色体”DNA、质粒DNA 病毒核酸： DNA、RNA病毒 单、双链（环或线状） 核酸的理化性质 基因组大小：病毒、原核、真核生物基因组 化学性质：在一定pH范围内 DNA对碱相对稳定 RNA对酸相对稳定

分离纯化核酸的第一步 的过程。
裂解细胞、释放核酸
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
裂解细胞的方法







机械法裂解细胞： 机械 电动捣碎机 匀浆器破碎 石英砂研磨 高压挤压 物理 超声波破碎 液氮冷冻研磨 可用于植物细胞和细菌细胞的裂解。 由于机械法损坏高分子量的线性DNA分子，一般不 提倡。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的浓缩与洗涤
（三）核酸的沉淀浓缩与洗涤

浓缩提取液中核酸 ，同时进一步除去杂质和无机离 子的过程。
浓缩方法： 有机溶剂沉淀 是浓缩核酸和进一步去除杂质的最 好方法，是必不可少过程。 常用：盐类（醋酸铵） + 有机溶剂（乙醇）沉淀法。

洗涤 70-75%乙醇洗涤是同时沉淀核酸和去除盐类 的方法。

核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
（二）保持核酸的完整性和纯度
影响完整性的因素： 物理 机械力、高温、辐射等 化学 强酸、强碱、有机溶剂 生物学 DNA酶(DNase) 、RNA酶(RNase)


核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度




措施： 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 : 1．保持低温（0º ～4℃），避免剧烈搅拌，避免辐射。 2．防止过酸、过碱。 缓冲液pH 4-10（DNA的pH8.3，RNA的pH4.5-5.5） 3．防止核酸酶的作用。 DNase抑制剂-- EDTA络合 Ca++,Mg++二价阳离子; Rnase抑制剂— 异硫氰酸胍等。
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
影响纯度的因素： 核酸污染 如外源核酸 蛋白质、多糖、脂类物质的污染 化学试剂污染…… 措施： 在建立和选择有效的分离纯化方法基础 上，避免污染：所有器皿清洁消毒、无 菌操作；用于分离不同核酸的器材应分 开，尽量采用一次性用品；增加纯化步 骤。

核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计

核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
吸光度换算为浓度： 1.000A260=50ug/ml ds-DNA（双链DNA） 1.000A260=33ug/ml ss-DNA （单链DNA） 1.000A260=40ug/ml ss-RNA （单链RNA）

背景扣除： A260- A310(盐吸光度)
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
非机械法裂解细胞： 干燥法 溶胞法 化学试剂与蛋白水解酶裂解细 胞，方法温和，有较高得率和较好核酸 完整性，普遍采用，如SDS-PK裂解细胞。

核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的分离与纯化
（二）核酸的分离与纯化

分离与纯化：利用一个或多个理化性质上的区别从 复杂的细胞裂解物中提取核酸或除去污染物的过程。 应去除的三类污染物： 1、非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖、脂类； 2、非需要的核酸分子； 3、对后续研究与诊断有影响的溶液与试剂。

步骤越多，纯度越高；步骤越少，结构完整性越好。