生物化学实验报告
姓名： XXX
学号： XXXXXXXXXX
专业年级： 2015级护理（助产）组别：第六实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
实验日期2016-10-18 实验地点第六实验室
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。
2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。
3、熟悉分光光度计的用法。
二、实验原理
1、在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
2、蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
3、在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。
三、材料与方法：
1.实验材料
（1）样品
健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L
（2）试剂
牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）；碱性硫酸铜溶液（当日有效）；Folin-酚试剂（3）仪器与器材
V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸
2.实验步骤
流程图：
（1）取6支试管做好标记，再按下表加样：（1作空白对照，2-5作标准试管，6为待测样品）
试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液- 0.20 0.40 0.60 0.80 - 样品液（稀释300倍）- - - - - 0.50 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.50 碱性硫酸铜 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Folin-酚试剂0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 蛋白质浓度（μg/ml）0 40 80 120 160 未知（2）往各试管中按表格要求加入蛋白标准液、样品液、蒸馏水及碱性硫酸铜试剂后，混匀室温静置10min。
（3）向各管内加入Folin-酚试剂0.20ml，并于2s内迅速摇匀。
（4）加样完毕后，将各试管进行40℃水浴10min。
（5）冷却至室温后，以500nm波长比色，以1号管作空白对照，按2-6顺序测定试管内溶液吸光度并重复测三次，记录数据并计算结果。
四、结果与讨论：
1.结果：
（1）数据记录：
各管A值
测定次数
2 3 4 5 6
1 0.099 0.174 0.279 0.327 0.269
2 0.100 0.174 0.280 0.328 0.270
3 0.100 0.175 0.280 0.329 0.270
0.100 0.174 0.280 0.328 0.270 各管平均值A
500
（对照组实验数据均为0）
（2）实验现象：
①向各试管中加入2ml碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液无明显变化；
②在向试管中加入0.20mL Folin-酚试剂并立即摇匀后观察到：溶液先变黄后变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深。
（3）绘制标准曲线：
值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线以A
500
试管 1 2 3 4 5 6
C（μg/ml）0 40 80 120 160 --
A(吸光度）0.000 0.100 0.174 0.280 0.328 0.270
（4）结果计算：
将测得样品管吸光度0.270代入标准曲线公式y=0.0022x中，得出样品浓度为122.73µg/ml。
即：C
（未稀释蛋白含量）= C
（稀释后蛋白质含量）
×2×300
= 122.73µg/ml×600
= 73638µg/ml
= 73.64g/L
正常人血清蛋白浓度参考范围为：60~80g/L
以上根据所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度在正常范围内，可认为本次实验成功。
（Folin-酚试剂法实验结果图）
2.讨论：
（1）本次实验操作较为简单，操作严格按照实验要求进行，所测样品结果73.64g/L 落在正常范围内，与同实验室其他小组所测结果相比差距较小，故可认为本次实验成功。
（2）实验误差分析：
①在加样过程中因试液未完全放入试管而有少量残留于移液枪头导致的操作误差。
②加入Folin-酚试剂后未能及时摇匀或水浴时间过长造成Folin-酚试剂被破坏。
③所使用分光光度计的数值不稳，或在读数时未等读数稳定就读数均可导致测量误差。
④比色皿外壁没有擦拭干净，外壁残留的水珠及指纹等均可导致实验误差。
3.思考题：
（1）Folin-酚试剂法的优点？
①测定蛋白质灵敏度高，较为准确，比双缩脲法灵敏约100倍；
②操作简单，原理清晰易懂，不需特殊仪器设备；
③适用性广，除测定蛋白质的含量，还可特定的适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
（2）应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？
①干扰作用：能干扰双缩脲反应的基团（如-CO-NH
2、-CH
2
-NH
2
、-CS-NH
2
）以及在
性质上是氨基酸或肽的缓冲剂（如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物），还有反应的时间差异，均可干扰Folin-酚反应。
②原因：此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂而成，故凡干扰双缩脲反应的因素亦可干扰本方法。
同时因此反应的显色随反应时间不断加深，故反应时间的差异亦为应用本方法的一个干扰作用。
③注意事项：在实验操作过程中应避免因操作不规范引起的实验误差，避免加入
干扰物质，并严格控制实验时间。