牛乳中酪蛋白得制备与浓度测定
一、实验目得
1、学习从牛乳中分离酪蛋白得原理与方法
２、掌握等电点沉淀法提取蛋白质得方法
3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理,熟悉紫外分光光度计得使用
4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度
二、实验原理
1、准备酪蛋白原理:牛乳中主要含有酪蛋白与乳清蛋白两种蛋白质,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质得80%、牛乳在PH４。

7时酪蛋白等电聚沉后剩余得蛋白质统称为乳清蛋白、酪蛋白就是白色、无味得物质,不溶于水、乙醇等有机溶剂,但溶于碱溶液。

乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子得水与能力很强,分散性高,在乳中呈高分子状态。

本法利用等电点时溶解度最低得原理,将牛乳得PH调至4。

７时,酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。

2、紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理:大多数蛋白质由于有酷氨酸与色氨酸得存在,在紫外光280nm有吸收高峰,可以进行蛋白质含量得测定。

但就是核酸在２80nm也有吸收,干扰测定,不过核酸得最大吸收峰在２６0nm,通过测定在28０nm与260ｎｍ时Ａ得比值,然后通过计算消除核酸存在得影响,可以求得有核酸存在时蛋白质得浓度。

3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理:考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝Ｇ250得磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm、当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为5９5nｍ,考马斯亮蓝G２5０—蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。

在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度得测定。

三、实验器材与试剂
1、制备酪蛋白:
烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅
牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、9５%乙醇、无水乙醚
２、紫外光吸收法:
紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿
0.9％NaＣl、1ｍoｌ／LNaOH溶液、1ｍol/Ｌ乙酸溶液
3、考马斯亮蓝法:
紫外可见光分光光度计、试管1．5cm×１5cm(×9)、玻璃比色皿
牛血清白蛋白(0.1ｍg／ｍl)、考马斯亮蓝、0。

9%ＮaCl
四、实验步骤
制备酪蛋白
1、将20mL pH４。

７得醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃
２、将2０ｍＬ牛奶加热至４0℃,在搅拌下缓慢地加入20ｍL预热得ｐH4。

7得醋酸—醋酸钠缓冲液
3、用精密pH试纸调pＨ至4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液
４、待悬浮液冷却至室温,400０ｒｐm离心5min,弃上清,得酪蛋白粗制品
5、用蒸馏水洗沉淀3次,3000rｐm离心5min,弃上清
6、在沉淀中加入20mＬ９5％乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤
7、用乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀2次(1０ml／次),最后用乙醚洗涤沉淀2次(1０mｌ/次),抽干
8、将沉淀摊开在表面皿上,风干,得酪蛋白纯品
９、准确称量,计算含量与得率
紫外光吸收法
１.取待测样品溶液置于得石英比色皿中,于分光光度计波长２80ｎm与260nm,分别读取A２8０nm与A2６0nm,用生理盐水为比色空白对照。

2.若A280nm/A２60nm>１、5,用公式:蛋白质含量(ｍg/ｍl)=A２8０nｍ／6、3＊1０
若A２80ｎm/Ａ2６０nｍ<1。

5,用公式:蛋白质含量(ｍg／ml)＝１．4５Ａ280nm —0。

7４Ａ260nm
考马斯亮蓝法
取９支干净试管,按表进行编号并加入试剂、
混匀,室温静置３miｎ,以第1管为空白,于波长５95nm处比色,读取吸光度,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(μg/mｌ)作为横坐标作图得标准曲线。

五、实验数据
酪蛋白质量:0.５421g
酪蛋白含量:２.7１g/１００ｍl牛乳
0．76９A A260nｍ0.９5９Ａ
紫外光吸收法:Ａ280
ｎm
Ａ280nm/Ａ２60ｎm<1。

5,蛋白质含量(mg/ml)=１。

４５A280
—０.７4Ａ
ｎm
=0、405mｇ/ml
260nm
蛋白质浓度为ﻬ。