细胞悬浮液制备（浓度为1～5×106个/ml）
细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）
细胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等）
封闭（3%BSA-PBS等）
一抗孵育
荧光二抗孵育
流式细胞仪分析
流式细胞术常见结果分析
直方图：单参数分析
人外周全血细胞双参数散点图
散点图：多参数分析
UL 0.70 UR 24.2
LL 52.80
一 抗
抗 原
细 胞
3，3-二氨联苯胺（DAB） 显色剂
组织切片/芯片制作
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚 至上千个不同个体的组织标本集成在一张固 相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及DAN 分子，是一种高通量的研究分析工具。研究 者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状 态下的组织标本来研究特定基因及其所表达 的蛋白质与疾病之间的关系。
3.荧光猝灭快
荧光素本身特性决定，光稳定性差，建议 选用光稳定性好的荧光素二抗。
4.细胞有自发荧光
使用了戊二醛固定，建议在固定后荧光染 色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4， 甘氨酸等，染色前检查自发荧光。 材料本身（如石蜡）有自发荧光，建议设 立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来 消除背景染色。 细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例 如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细 胞中死细胞／活细胞比例高；
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
LR 22.3
常用细胞表型及意义：
（Cluster of Differentiation, CD）
CD3 CD4 CD8 CD19
总T细胞 T辅助/诱导细胞亚群 T抑制/细胞毒细胞亚群 B细胞抗原
LL: CD3-CD4- B细胞群+细胞 毒T细胞亚群 LR：CD3+CD4- 细胞毒T细胞亚 群 UR：CD3+CD4+ T辅助细胞亚 群
免疫荧光原理示意图
免疫荧光实验过程
细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%）
细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）
细胞膜穿透（ Triton X-100 等）
封闭（3%BSA-PBS等）
一抗孵育
荧光二抗孵育
胞浆/核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI）
封片荧光显微镜拍照
免疫荧光结果分析
免疫荧光双染色抗体的选择
免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析
宋砚明 song_yanming@
免疫组化（IHC）的应用介绍
免疫荧光（IF）的应用介绍 流式细胞术（FC）的应用介绍
IHC、IF、FC区别与联系
免疫组织化学 （Immunohistochemistry, IHC）
2. AEC显色法
产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9eoxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生 溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中 复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物 酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC 显色原和与之配套的稀释液。 试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）
免疫荧光常见问题分析
1.背景过高
一抗质量不高，建议使用特异性高、效价 高的一抗。 一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗 浓度。 封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间。 洗涤不充分，建议增加冲洗次数与时间。 可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景。
2.信号弱或无信号
无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达 量高的细胞或组织。 细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时 间或浓度。 一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度。 二抗选择错误（种属不匹配），建议选用 与一抗种属相匹配的二抗。
免疫组织化学原理及特点
利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记 技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细 胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的 一门技术。 免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
辣根过氧化物酶（HRP）
二 抗
棕褐色络合物
IHC
反 应 原 理 示 意 图
用普通的封片剂封片，建议选用防荧光猝 灭剂封片。
流式细胞术
（Flow Cytometry, FC）
流式细胞术定义及原理 流式细胞仪（FLOW CYTOMETOR）： 进行流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电测量， 计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞 分析仪。 流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）:
3. BCIP/NBT显色法
产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、
western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色
4. BCIP/INT显色法
荧光补偿示意图
Annexin V-FITC/PI凋亡检测原理
在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS） 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中 。 Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白 ，能与磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。 将Annexin V进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了 的Annexin V-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微 镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透 过完整的细胞膜，但在细胞凋亡中晚期的细胞和死细胞，碘化 丙啶PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin V 与 PI 匹配使用，就可以将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分 开来。
利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行 多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和 分选（纯度可达99%以上）的技术。
荧光物质（FITC,PE等）
二 抗
不同颜色的 激发光
反 应 原 理 示 意 图
FC
一 抗
抗 原
细 胞
激光源
转化为计算机 识别数据
流式细胞仪工作原理图
流式细胞术实验过程
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 免疫组化染色（IHC）； 原位杂交（ISH）； 荧光原位杂交（FISH）； 原位末端标记分析（TUNEL）； 原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
3. Polymer酶标二抗法
原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做 为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可 再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具 有很高的信号放大作用。 特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进 行内源性的生物素封闭。
4. 直接酶标二抗法
该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗 上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实 验简单，成本低，但是因为没有信号放大作 用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就 可能检测不到。
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
3.显色强度弱
一抗浓度过低或孵育时间过短，建议增加 一抗浓度或延长孵育时间。
4.无染色
组织中无目的抗原的表达。 一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前 确认一抗的种属来源。 显色物质与HRP系统不匹配，建议实验前 确认显色体系。
直接法： 一抗种属来源无要求 标记两种不同荧光素 的一抗。
间接法： 一抗种属来源来源不 同 二抗分别标记不同荧 光素。
各种荧光染料原理及选择
细胞核衬染染料： DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料它可以透过完整的细胞膜，因 此以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为358nm，最大发射波长 为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。 Hoechst 33342 是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在紫 外激发光作用下发出兰色荧光.能够透过完整的细胞膜，可用于活细胞染色。 碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧 光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PIDNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。 细胞浆衬染染料： 鬼笔环肽（phalloidin ）由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种 环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F 肌动蛋白的重要试剂。 荧光抗体的选择： 绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等。 红色荧光素：PE，Alex546等。
产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、