流式细胞仪可以做什么？
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分析型流式细胞仪
分选系统
分选型流式细胞仪
（1）液流
液流系统
流动室
流动室（Flow cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
中性粒细胞 单核细胞
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发 后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 • 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波 长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信 号区分开，送入不同的光电倍增管。 • 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多 个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
红 色 荧 光 强 度
绿色荧光强度
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 • 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等 高”。 • 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 • 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
二维等高图
不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在 悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后 不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。 因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给
基因的特异性编码；而液相芯
片则是用颜色来编码）
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维 等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数， 根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。
• 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每 个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
1.双参数直方图点图
就可以由四个区域构 成，即
G=D1+D2+D3+D4。
D1 CD4+/CD3-
D2 CD4+/CD3+
D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
• 样本制备
• 标记染色 • 液相芯片技术 • 质量控制
一、免疫检测样品制备
单细胞悬液
外周血淋巴细胞样品的制备
荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的
乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对
PEcy5
能量传递复合染料
常用的几类荧光染料
名称 异硫氰酸荧 光素 得州红 藻红蛋白 藻青蛋白 别藻青蛋白 能量传递复 合染料 染料 FITC Texas red PE PC APC PEcy5 激发 波长 488 568 488 488 633 488 红 670 红 670 易 不敏感 减少交叉，成本高 荧光颜 色 绿 525 红 615 橙 575 易 不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高 溶解性 易 不易 对PH敏感 性 敏感 不敏感 特点 易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 稳定，偶联后量子产 额低
光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4 （荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
Hale Waihona Puke 脉冲信号计算机系统 分析结果
二、散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分 为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
• 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映
同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
3. 假三维等高图
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧 光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的
细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样
本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
层流水力聚焦技术
光学系统
—Light scattering at FSC
represents the particle size and area
—Light
scattering at SSC depends on granularity and complexity of the particle
分离单个核细胞
培养细胞的样品制备
蛋白酶消化 机械吹打 洗涤 尼龙网过滤
使贴壁细胞脱落
新鲜实体组织单细胞悬液的制备
• 机械法 • 酶处理法 • 化学试剂处理法 • 表面活性剂处理法
单细胞悬液的保存
• 深低温保存法（一年） • 乙醇或甲醇保存法（2周） • 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
二、常用的荧光染料与标记染色
二、淋巴细胞功能分析
• 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) • 细胞内细胞因子测定
三、淋巴造血系统及白血病免疫分型
•对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 •用于选择化疗方案、判断预后及检出微小 残留病变
四、肿瘤耐药基因分析
MDR(+)表示对化疗药物耐药
五、AIDS病检测中的应用
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎(As) 患者
七、移植免疫中的应用
不充电 弃去
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中
细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百
分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点
的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的
总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与 分选速度成反比。
T淋巴细胞及其亚群分析
Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)
B淋巴细胞及其亚群分析
B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与 自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体
NK细胞分析
NK(CD3-CD16+CD56+)
荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱
压电晶体 产生机械振动
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
• 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次
实验结果可靠。
第四节
在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式 细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，
可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增
加了有效的手段和帮助。
一、淋巴细胞及其亚群的分析
通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析
四、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
• 适当的制备方式 • 处理红细胞 • 实体组织来源标本用机械法 • 温度25~37℃，pH7.0~7.2
（二）免疫荧光染色的质控
• 温度 • pH • 染料浓度 • 固定剂
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激 发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另 一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。