建议在实验过程中，对比前面的气相色谱实验技术，进 一步巩固和提高所学知识和实验技能。
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一、色谱分离原理
色谱法是一类高效分离方法。 ➢ 色谱分离原理是什么？ ➢ HPLC和GC仪器的分离部件是什么？ 它们有什么不同？ ➢ HPLC和GC的主要差别？
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二、色谱分析技术
色谱分析是一类重要的仪器分析方法，其特
点是分离能力强、定量准确，适合于复杂样
品或多组分样品分析。
➢ 常见的色谱定性方法？
➢ 色谱定量分析的依据？
➢ 气相色谱实验采用那种定量分析方法？有
何特点？
➢ HPLC和GC的应用特点
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三、 HPLC仪器和实验技术
➢ HPLC仪器的基本组分？ ➢ 主要部件的工作原理？ ➢ HPLC和GC仪器的比较 ➢ HPLC和GC实验技术的比较 ➢ 有人认为色谱分析实验很简单，就是打一 针样品而已，你是怎么认为的？你是否给病 人打过针？为什么没有？
For Short：HPLC
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实验目的
➢ 了解HPLC仪器基本结构,掌握实验仪器的一般使 用方法；
➢ 加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件 的选择；
➢ 掌握液相色谱定性定量分析技术。
实验内容
反相高效液相色谱法分离测定烷基苯系物
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实验讲解要点
一、色谱分离原理 二、色谱分析技术 三、 HPLC仪器和使用方法 四、 HPLC和GC的比较 五、 RP-HPLC测定烷基苯化合物原理
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HPLC的溶剂选择
➢ 本实验采用什么流动相？ ➢ 什么是HPLC级甲醇、乙腈溶剂？ ➢ 如何获得超纯水？ ➢ 本实验所用的流动相如何配制？ ➢ 流动相为什么要除气？如何除气？
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六、实验部分
一、溶液配制
1 配制标准系列溶液
三组分混标液：每mL溶液分别含1.00mg苯、甲苯 和乙苯。 分别准确移取0.40、0.80、1.20、1.60和2.00mL 三组分混标液于10mL容量瓶中，用流动相溶剂定容。
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四、高效液相色谱仪的基本组成
分几个系统？ 和GC有何不同？
高压泵工作原理？
GC是如何进样的？
记录系统和GC一样 吗？
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高压泵工作原理（单向阀）
➢ 高压液体有危险吗？ ➢ 高压泵如何改变流速？
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高压泵工作原理（单向阀） 六通阀工作原理（流路切换）
➢ HPLC进样针与GC有何不同？
2 流动相的配制、过滤和除气。
五组分混标液：含适量苯、甲苯、乙苯、丙苯和丁苯。
标准苯测试液。 未知样品1号、2号和3号。
归一化法所得色谱图
在FID上，各种烃类的相对质量 校正因子都很相近，混合芳烃中 各组分的百分含量近似等同于面 积的百分含量
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顶空进样：只抽取平衡蒸汽 顶空进样基体干扰少，可应用于新房子中甲醛含
量的检测等。
采用面积归一化法测定组分含量时，抽取 气体体积不一样时，那么的测定的结果是 否一样？
高 高 较大
低 低 1-2 μL
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检测器
检测器
载气种类
测定浓度
应用
热导(TCD) (FID) (ECD) (FTD) (FPD)
氦，氢，氩，氮 氦，氮 氮 氦，氮 氦，氮
50 ppm 数ppm 数ppb 数ppb 0.1 ppm
通用检测器 有机化合物 有机卤素等 氮，磷化合物 硫，磷化合物
填充拄
材料
柱长 内径
熔融的石英拉制而成，外 不锈钢做为外壳材料，里面
层是聚酰亚胺，使整个毛 填充一些材料，比如活性炭、
细管柱有韧性
氧化铝、硅胶等
短，1-10 m
长，20-200 m
2-4 mm
0.25 mm，0.53 mm
固定相 活性炭、氧化铝、硅胶等 液膜，厚度为0.25 μm
理论塔板数 柱效
允许进样量
归一化法定量特点：简单、方便，其结果 与进样量无关，仪器条件稍有变化对结果 影响不大
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外标法
配制一系列不同浓度的样品进行色谱分析，做出峰面积对 浓度的工作曲线
浓度为100，500，1000 ppm，直接进样1 μL
归一化法所得色谱图
工作曲线
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外标法测定样品时对体积要求如何？是否像归一化法一 样，进样体积不一定要非常准确？
外标法不同于归一化法，它对进样体积的要求 非常严格，一定要很准确，这样才能得到较好 的定量依据。
归一化法测得的是百分含量
不同仪器得到的工作曲线是不一样的，在做实 验的时候，要使结果准确，还要对工作曲线进 行及时的校正
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实验2高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
原理: 基于物质在不同
相之间具有不同的分配
系数引起的分离
Chromatography
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色谱种类
• 气相色谱 • 液相色谱 • 超临界流体色谱 • 薄层色谱
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仪器装置
进样口
柱箱
面版显示和控制
气路控制系统
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➢进样口
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➢色谱柱
毛细管柱 填充柱
毛细管柱
➢ 为什么HPLC与GC进样要求不同？
五、 RP-HPLC测定烷基苯化合物 原理
➢ 什么是正相色谱？什么是反相色谱？ ➢ 什么是键合固定相？ ➢ 预测一下苯和甲苯在C18反相柱上的保留 顺序？ ➢ 什么是反相色谱疏水机理？ ➢ 本实验的主要色谱分析条件有那些？ ➢ 流动相组成对保留时间有何影响？举例说 明？ ➢ 改变检测波长对色谱图有何影响？
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➢数据采集及处理系统
➢温控系统
进样系统
柱箱 控 温
检测器
辅助部分
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实验内容
归一化法测定混合芳烃中各组分的百分 含量。
面积外标法定量测定气体中甲苯含量
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归一化法
气相色谱中，把所有出峰组分含量之和以百分之百计算的 定量分析方法称为归一化法
样品中所有组分都能从色谱柱流出来并被检测到 各个组分的含量不能相差太大
《仪器分析实验》
仪器分析实验
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实验1 归一化法测定混合芳烃中各 组分的百分含量
气相色谱法
仪器分析实验的结构，掌握基本使用方法 • 掌握归一化法的原理以及定量分析方法 • 掌握外标法和外标工作曲线法在气相色谱定量分 析中的应用。
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色谱起源
加入石油醚分层
•胡萝卜素 •叶黄素 •叶绿素A、B