• 等位基因突变频率=4/14=28.5% • 未突变的DNA来自正常组织或肿瘤中的其他亚克隆
EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合， 但有1/4为与其他基因的融合，包括：
• STRN-ALK • CATSPERB-ALK • ACVR1-ALK • CLIP1-ALK • DPH6-AS1-ALK • KIF5B-ALK • RP11-320M2.1-ALK • UGP2-ALK
• 1987年，KRAS基因突变在当时50%的肺腺癌患者中被发现。 • 2004年，EGFR突变作为新的肺腺癌驱动基因被发现。 • 2014年，随着TCGA计划的完成，肺腺癌的基因突变图谱被进一步完善。
NGS在肿瘤临床领域的应用
组织
遗传易感性 伴随诊断用药指导
良恶性判断 复发与疾病进展监控
早期筛查
ddPCR血液 已知
难（已知） 已知 已知 好 已知
难（已知） 已知
NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类
• MET 14 exon skipping，HER2 20 exon insertion等情况复杂的突变 • EGFR等热点基因的非热点突变位点 • ALK等热点基因的非常见融合方式 • 罕见的EGFR-19Del 可能会造成PCR方法假阴性
NGS与ddPCR在肺癌8基因检测对比
NGS组织
NGS血液
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
可以
难
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
ddPCR组织 已知 已知 已知 已知 很好 已知 已知 已知
NGS能够发现新的耐药机制
发现AZD9291获得性耐药机制---C797S突变
15例患者一代TKI进展， T790M+，应用
AZD9291后耐药，经检 测发现三种类型：
6例出现C797S 5例仍保持T790M，无 C797S T790M消失
Thress KS et al, Nat Med.2015 Jun;21
有研究发现T790M和C797S突变分子顺式/分子反式信息影响EGFR TKI治疗疗效； NGS和ddPCR都能够提供EGFR突变的in cis/in tran信息，具有重要的临床意义， 传统PCR检测则会遗漏这一信息；
K.S. Thress, et al. Nat Med, 2015. 21(6): p. 560-562.
与EGFR不同ALK-TKI的耐药机制更加复杂
• NGS检测EGFR和ALK的 耐药位点都没有问题。
• ddPCR只能做T790M这 种比较集中出现的耐药位 点检测。
随着建库技术和生物信息分析策略的进步NGS液体 活检敏感性已经远超ddPCR
NGS检测能够帮助分析肿瘤克隆的进化
评论：相比反复活检 在临床面临的巨大挑 战，ctDNA动态随访 是对肿瘤克隆进化监 控的最佳方式
血液
NGS在肺癌临床领域的应用
非小细胞肺癌
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ遗传易感性
伴随诊断用药指导 良恶性或分子分型
NG + ddPC
S
R
复发与疾病进展监控 早期筛查
NG + ddPC
S
R
NG S
肿瘤的异质性对传统分子组织诊断提出了挑战
NGS和ddPCR都能够报告等位基因突变频率， 反映不同亚克隆的比例关系
NGS和ddPCR都是通过计算，看检测出多少带有突变的DNA（突变型），和 检测到的所有的DNA（野生型+突变型）的比值来确定等位基因突变频率 （AF）。
测序技术的发展带来靶向治疗的纵深研究
Li TH, et al. J Clin Oncol 31:1039-1049
PCR技术也经历了3代的进化
对NSCLC驱动基因的认知随着分子检测技术 的进步在不断深入
Ashley J. Vargas et al，Nature Reviews Cancer 16, 525–537 (2016)
N. Rizvi et al, Science, vol 348, 2015
基于NGS的血液DNA甲基化检测能够满足肺癌 早诊的需求
Delpu et al. Int. J. Mol. Sci. (2013) PNAS
感谢聆听
基于靶向捕获的NGS能够同时检测已知突变 和未知突变
ddPCR
热点1
Capture NGS
检测基因
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NCCN指南建议初诊患者进行多靶点平行检测
针对非小细胞肺癌的8个基因NGS可以完全覆盖
检测基因型 EGFR突变 ALK融合 HER2突变 BRAF突变 MET扩增 MET14外显子跳读 ROS1融合 KRAS突变
在肿瘤克隆进化的过程 中，劳拉替尼耐药相关 亚克隆L1198F重拾对克 唑替尼的敏感性
Shaw AT et al, N Engl J Med. 2016;374(1):54-61. Bordi P et al, N Engl J Med. 2016;374(18):1790.
全外显子测序结果有助于评估接受免疫治疗的患者预后