第七章土壤微生物区系分析 (92)第一节一般土壤微生物的分离与计数 (92)一、稀释平板法 (92)二、MPN稀释法 (94)三、土粒法 (96)第二节厌氧微生物的分离 (96)一、充氮厌氧培养法 (96)二、焦性没食子酸吸氧法 (97)三、专性厌氧细菌的分离法 (98)第三节土壤主要类群微生物的分离与计数 (99)一、好氧细菌的分离与计数 (99)二、丝状真菌的分离与计数 (100)三、放线菌的分离与计数 (100)第四节土壤中功能微生物的测定 (101)一、氨化细菌的测定 (101)二、硝化细菌的测定 (102)三、反硝化细菌的测定 (104)四、好氧性自生固氮细菌的测定 (105)十一、纤维分解菌的测定 (106)十二、光合细菌的测定 (108)十三、甲烷产生菌的测定 (109)十四、有机污染物降解菌的测定 (110)十五、重金属抗性菌的测定 (111)第八章根圈微生物分析 (111)第一节根圈细菌的分析 (112)一、根圈的分区 (112)二、根圈细菌的分离 (112)三、根圈优势菌株的分群 (114)第二节植物组织内微生物的分离 (115)一、植物材料的选择 (116)二、组织表面消毒 (116)三、分离方法 (117)第十五章土壤微生物生物量的测定 (119)第一节土壤样品采集与预处理 (119)第二节土壤微生物生物量碳分析 (120)一、熏蒸提取——容量分析法 (120)第三节土壤微生物生物量氮分析 (124)一、熏蒸提取——全氮测定法 (125)二、熏蒸提取——茚三酮比色法 (127)第四节土壤微生物生物量磷分析 (129)一、熏蒸提取——全磷测定法 (129)第十七章土壤生物化学过程强度测定 (130)第一节土壤呼吸作用 (130)一、密闭静置培养测CO2法 (130)二、通气培养测002法 (131)三、田间收集C02法 (132)第二节土壤氨化作用 (133)一、土壤培养法 (133)二、氨化菌培养液培养法 (134)第三节土壤硝化作用 (135)一、土壤培养法 (136)二、培养基接种土壤悬液法 (137)三、纯菌培养法 (138)四、环流法 (139)第四节土壤反硝化作用 (140)一、硝酸盐消失法 (140)二、气相色谱法 (142)第五节土壤固氮作用 (145)一、土壤培养测全氮法 (145)二、无氮培养液培养法 (146)三、乙炔还原法 (147)第六节土壤磷素的转化作用 (151)第十八章土壤酶活性测定 (152)第一节氧化还原酶 (153)一、脱氢酶 (153)二、多酚氧化酶 (154)三、过氧化氢酶 (155)四、过氧化物酶 (156)五、硝酸还原酶 (158)六、亚硝酸还原酶 (159)七、硫酸盐还原酶 (160)第二节水解酶 (161)一、脲酶 (161)二、蛋白酶 (163)三、α-淀粉酶和β-淀粉酶 (164)四、脂肪酸 (165)五、转化酶（蔗糖酶） (166)第七章土壤微生物区系分析土壤是微生物生活的大本营，也是人类开发利用微生物资源的重要基地。
土壤微生物区系（soil microflora）是指特定土壤生态系统中生活的微生物的数量和组成状况，是反映土壤微生物生态特征的重要指标。
由于在不同的地理地带、不同的土壤类型、不同的季节和不同的土壤条件以及农业措施等影响下，微生物的数量组成是不同的，因此，对了解不同土壤生态系统中微生物区系的动态变化及挖掘所需的土壤微生物资源，与对了解土壤基本理化性质一样，仍具有重要的现实意义。
第一节一般土壤微生物的分离与计数从自然界或混有杂菌的培养体系中将所需要的微生物在培养基上形成单个菌落，称为菌种分离。
分离土壤微生物的方法很多，但是所有的方法都有一定的局限性，因此也各有利弊．常用的有稀释平板法、MPN(most Probable number)稀释法和土粒法。
一、稀释平板法稀释平板法是测定土壤中活的微生物数量最常用的一种方法。
该方法操作简便，而且可以同时从土壤中分离获取较多种类的微生物，井进行计数。
（一）基本原理本方法是基于这样的假设，即当已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生物与土粒分开，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中微生物的数量。
土壤中微生物的数量很多，因此必须取少量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌落可以很好地分散开来，以便于计数和移植。
（二）操作步骤1)用1／100感量的天秤称取10g土样加入盛有100mL无菌水的500mL 三角瓶中。
同时称取待测土样10~llg(记下准确质量)，经105'(2烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，按下式计算土壤含水量的百分数。
土壤含水量(％)=（湿土重—干土重）/湿土重*1002)将盛有10g土样和100mL无菌水的三角瓶放在振荡机上振荡10min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。
3)土壤分散后，吸取1mL土壤悬液到9mL稀释液中(或吸5mL到45mL稀释液中)，依次按10倍法稀释，通常稀释到10-6。
所用的吸管在每次吸取悬液时，在稀释中反复吸人吹出悬液3~5次，以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散。
4)根据各类微生物在土壤中的数量多少选择经过适当稀释的悬液接种。
一般真菌采用的稀释度为10-3一10-1，放线菌为10-5～10-3，细菌为10-6 10-4，每一稀释度必须重复3~5次，重复越多，越准确。
’5)土壤悬液接种刮刀法先于灭菌培养皿中倾注18mL左右选择性培养基，凝固后，用1mL无菌吸管于瑚9表面加0.05mL(相当于1／20ml)或用无菌移液枪吸50μL一定稀释度的土壤悬液，然后立即用玻璃刮刀将悬液均匀地涂抹于琼脂表面。
混菌法吸取1mL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷至45℃的选择性培养基约15mL与培养皿中的土悬液充分混匀，待凝固后倒置保温培养。
6)接种了土壤悬液的培养皿，待培养基凝固后倒置于28～30'C恒温箱中培养一定时间(细菌2~3天，真菌3～5天，放线茵5~7天)后取出，细菌和放线苗选取出现菌落数在20~200的培养皿，真菌选菌落数在10～100的培养皿，被扩散性细菌或真菌菌落占据琼脂表面15％的培养皿应该剔除，因为它们抑制了其他菌落的正常发育，从而造成试验误差。
7)结果计算用刮刀法接种的计算方法：用混菌法接种的计算方法：通常以cfu (colony forming unit)／g千土表示。
(三)注意事项1)用同一支吸管接种同一样本不同稀释度的悬液于培养皿时，应从高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液。
2)分离细菌时，为了避免由于某些细菌菌落扩散造成误差，倒皿时培养基温度不宜太高或待倒人的培养基凝固后，将培养皿微启，倒置于60~ 70℃烘箱中15~20min，待琼脂表面冷凝水烘干或隔夜平板经检查确认无菌后，用同法涂抹土壤悬液。
3)分离芽孢杆菌时，应事先将样品中无芽孢细菌杀死。
所以要预先选取适当稀释度的土壤悬液于75~80'C水浴中煮15rain，然后再按上述方法涂抹于琼脂表面。
4)稀释平板法可因下列原因造成误差，因而对土壤中实际存在的微生物数量可能估计过低：①土壤悬液中有的菌成群聚集在一起或附在土粒上未被分散，因此在乎板上形成的菌落数比实际菌数低；②稀释液可能杀死某些微生物，③有的孢子在这种条件下不Q9发芽，因而不能发育成肉眼可见的菌落；④有的细胞在操作过程中被吸附在管壁上；⑤培养基和培养条件有较高的选择性，以致相当一部分微生物不能正常发育形成苗落，5)稀释平板法并不是对所有的微生物类群都同样适用，一般来说这个方法最适用于苗体大小和重量都差不多的类群，如细菌和酵母。
放线苗和真菌因菌体的不同部分的大小和质量相差较大，如菌丝、孢子和其他孢子器等质量大小均有较大差异。
严格来说，用此法所得菌落多数从孢子发育而来，而且与菌丝发育而成的菌落不能区分。
6)用此法时干扰结果的因素较多，因此各个实验室对操作程序的每一细节都应有自己的规定，以便于结果之间的相互比较。
二、MPN稀释法对具特殊生理功能的细菌，常采用稀释法计数，又称最大或然数法。
如硝化菌、反硝化菌、厌氧固氮菌、硫化苗、反硫化菌、纤维素分解菌等。
(一)基本原理本方法是基于选择适当稀释倍数的土壤悬液，接种在特定的液体培养基中培养，再检查培养液中是否有该生理类群微生物的生长。
根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出每克土壤中某生理类群的微生物数量。
(二)操作步骤1)土壤悬液制备方法同稀释平板法1)一3)。
2)根据微生物各类群在土壤中的大概数量选择5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中。
每管接悬液1mL，每一稀释度重复5管(3—5管均可，重复越多，结果越准确)，即一个样品每种培养基25管。
3）于28℃培养7~14天，根据各生理群的生长或反映，分别记载结果。
4）根据各稀释系列试管中有无待测微生物生长或其生理反映的正负得出数量指标，并根据重复数量不同而在相应的稀释法测数统计表中查出细菌近似值。
应用稀释计数法计数时，菌液稀释度要合适，要求在稀释系列中最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而必须最后一个最高稀释度所有重复都没有微生物生长。
确定数量指标系取稀释系列中所有重复都有生长(或呈正反应)的最高稀释度为数量指标的第一位数字。
例如，稀释度10-110-210-210-4，10-5生长情况+ + + + + + + + + + + + + + - + + - - - - - - - -重复数 5 5 4 2 0数量指标为542，由表查得近似值为25。
如果在所有重复试管内都有微生物生长的稀释度之后仍有三个数字，则将最后二个数字加到前一个数字上。
例如，稀释度10-110-210-310-410-5生长情况+ + + + + + + + + - + + - - - + + - - - - - - - -重复数 5则数量指标为542+2=5445)结果计算每克干土中菌数＝设样品含水量为20％，则干土为80％每克干土中菌数＝25*102*100/80三、土粒法对于在土壤中数量较少的某些微生物，有人采用将土粒直接按种在选择性培养基上的方法来分离计数。
如好氧性自生固氮菌、纤维素分解苗及其他种类的微生物等。
(一)基本原理本法是把供试土壤颗粒，排列在适于某一生理类群微生物生长的选择性固体培养基上，这一类微生物的南落围绕着颗粒发育起来。
由这些颗粒在试样中所占的百分数可以得到这类菌在土壤中的含量及其近似值。
(二)操作步骤1)取少量土样加无菌水调成糊状。
2)用粗细适当的圆头玻璃棒沾糊状土样，点在已凝固的选择性琼脂平板上。
3)于28℃培养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。