质粒提取试剂盒说明书
质粒提取的质量和得率受多种因素影响,既和质粒本身的性质以及拷贝有关,也和菌液的状态及实验操作有关,因此在质粒提取中的一些实验要点显得就极为重要了。
质粒提取这看似简单的实验,却暗藏杀机,下面我们来看一下在质粒提取过程中那些习以为常的实验操作中的“误会“。
通常我们会认为越多的菌液或是越浓的菌液提取的质粒会越多,但实际实验中结果并非如此。
良好菌液的标准:
按1:1000的比例将菌液接种至培养基中,摇菌时间在8-12个小时,不超过16个小时。
菌液均匀悬浮于培养基中,无凝块、无沉淀,菌液的OD600吸光值在0.8-1.0之间,不超过1.2。
在提取质粒后进行凝胶电泳,如果在在超螺旋质粒的下方出现弥散条带,则是由于忘记加入RNaseA或RNaseA消化不充分,不完全降解的RNA与质粒共同被提取出来。
加入RNaseA的两个阶段:
在使用试剂盒提取质粒时,菌液重悬时在P1溶液中加入RNaseA
提取质粒后,在质粒溶液中加入RNaseA(试剂盒或溶液法)
RNaseA的使用方法:
RNaseA在质粒中的使用终浓度为20μg/ml
经RNaseA孵育的质粒,需要进行纯化去除残留的RNaseA
如何判断我们所使用的菌体量是否合适呢?在裂解时经几次颠倒混匀后,裂解液仍然为浑浊状态,说明未被裂解的菌体仍然悬浮在裂解液中,而充分裂解的菌体,溶液于裂解液中,裂解液呈现为澄清,质粒充分释放。
质粒小提试剂盒适合1-5 ml菌体的提取
小提中量试剂盒适合5-15 ml菌液的提取
中量提取试剂盒适合50-100 ml菌液的提取
大量提取试剂盒适合100-200 ml菌液的提取
如果我们想要增加提取的菌体量,也要相应提高所加入的裂解液体积。