培养基的配制和灭菌细菌的纯种分离、培养接种技术及菌落形态的观察姓名：***学号：************ 课程名称：环境工程微生物实验一、实验目的1、熟悉玻璃器皿的洗涤与灭菌前的准备工作。

2、了解微生物培养基的基本原理，掌握配制、分装培养基的方法。

3、学习各类物品的包装、配制、灭菌技术。

4、从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用微生物和纯化微生物的方法。

5、学会几种接种技术。

6、平板菌落计数。

7、抗Cu菌的筛选。

8、观察实验分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落的形态特征。

9、通过观察和比较细菌，放线菌，酵母菌及霉菌的菌落形态，达到初步鉴别微生物的能力。

二、实验原理1、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，有碳、氢‘氧、氮、磷、硫、钾、钙、钠、镁、铁、等微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。

调整适合的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。

由于微生物的种类及代谢类型的多样性，因而培养基放入种类也多，他们的配方及配制法也有所差异，但一般的配置过程大致相同。

本实验采用肉汤蛋白胨培养基、查氏培养基（筛选霉菌）、高氏1号淀粉琼脂培养基（筛选放线菌）。

2、灭菌原理:本次实验中培养基、移液枪头等采取加压蒸汽灭菌法。

加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。

培养皿等玻璃器皿用具采用干热灭菌法，另外还有膜过滤灭菌法。

接种时对接种针等采用灼烧灭菌。

3、分离纯化原理：本实验使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。

此法加样量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，现正置一段时间等水分蒸发后倒置。

平板划线法也可以分离从而获得单一菌落以观察其形态特征。

4、微生物的接种原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。

本次实验采取斜面接种法、穿刺接种法，使用到的接种工具是接种环，接种针。

5、菌落形态观察原理：由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。

按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可从菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬、表面光滑粗糙等情况，初步辨别是何种类型的微生物。

三、实验器皿和材料1、样品：河塘底泥2、仪器、器皿：高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱、恒温培养箱、pH计、电子天平，酒精灯、移液枪（枪头）、药匙、滤纸、镊子、接种环、接种针、玻璃刮刀、玻璃棒、滴管、锥形瓶500ml*2、250ml*3、烧杯500ml、250ml、50ml各一个，试管15支，玻璃培养皿20套，塑料培养皿15套，10ml移液管一支，，量筒500ml，100ml各一个，玻璃珠若干。

3、试剂或药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、蔗糖、NaCl、NaOH、NaNO3，MgSO4，FeSO4，K2HPO4，KCl，KNO3，Cu2+母液（0.4ml/L）。

四、实验过程（一）实验准备1、洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。

培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。

移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。

洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、备用。

2、包装（1）移液枪和枪头的包装：移液管的吸端用细铁丝（或牙签）将少许棉花塞入构成1-1.5cm长的棉塞，起过滤作用（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内）。

棉塞要塞的松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。

然后将塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结，待灭菌。

（2）培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对而放）包好。

（3）硅胶塞：硅胶塞四周应紧贴管壁和瓶壁，不能有折皱，以防空气微生物沿硅胶塞折侵入。

硅胶塞的直径和长度视试管和锥形瓶的大小而定，一般约3∕5塞入管内。

试管、锥形瓶塞好硅胶塞后，用牛皮纸包裹并用细绳或橡皮筋捆扎好，放在铜丝篓内待灭菌。

3.配制培养基、稀释水1半固体培养基（200ml）：牛肉膏1g蛋白胨2gNaCl 1gH2O200ml至250ml烧杯中，调节pH至7.0-7.2；导入500ml三角瓶，再加入琼脂1g300ml至500ml烧杯中，调节pH至7.0-7.2；导入500ml三角瓶，再加入琼脂6g。

3选择培养基（200ml）：牛肉膏1g蛋白胨2g，NaCl 1g，H2O 200。

2固体培养基（300ml）：牛肉膏1.5g蛋白胨3g，NaCl 1.5g，H2O ml至250ml烧杯中，调节pH至7.0-7.2；导入250ml三角瓶，再加入琼脂4g。

4霉菌培养基：NaNO3 2g ，MgSO4 0.5g ，琼脂15-20g，K2HPO4 1g，FeSO4 0.01g，KCl 0.5g ，蔗糖30 g，蒸馏水1000ml，pH自然条件，灭菌条件，0.072MPa(115℃，15-20min)【注：按比例配制200ml】5放线菌培养基：可溶性淀粉2g,FeSO4 0.5g，KNO31g，琼脂20g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，灭菌条件0.103MPa(121℃，15-20min)【注：按比例配制200ml】6稀释水的配制：用10ml移液管吸取9mlH2O至试管中(5支)塞棉塞包扎灭菌。

（二）灭菌1、湿热灭菌2、干法灭菌3、膜过滤灭菌（三）灭菌后的工作1、倒平板：将50摄氏度左右的培养基倒入培养皿中，约其二分之一。

2、斜面的制作：灭菌后要制成斜面培养基，应在培养基冷却至50-60摄氏度，用移液枪吸取5ml培养基至试管中，将试管搁置成一定的斜度，斜面高度不超过试管总高度的1∕3。

3、半固体培养基制作：用移液枪吸取5ml培养基至试管中，竖直放置于试管架中（4支）。

（四）细菌的纯种分离及培养1、取样：用无菌瓶取一定量的底泥，迅速带回实验室。

2、吸取1ml底泥至装有9ml无菌水的试管中，吹洗3次得到10-2稀释液，再换一支枪头吸取10-2稀释液1ml至装有9ml的无菌水的试管中，吸取三次，得到10-3的稀释液，以此类推得10-410-5稀释液。

3、涂布：用无菌移液枪吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋转涂布均匀（每个浓度重复两次）（固体培养基不含铜离子选10-3、10-4、10-5三个浓度，外加空白，含铜离子的培养基选10-2，10-3两个浓度）。

（六）细菌的接种1、平板划线：在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住硅胶塞将其拔出。

试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉将烧过的接种环伸入菌种管内，使环端轻触内管壁，冷却后取种，用接种环从培养皿中挑选2种菌落进行平板划线，斜面划线，每个菌落画划个平板。

2、穿刺实验用接种环挑选单菌落，笔直伸入半固体培养基中，不要弯曲，不要触底。

然后原路拔出，塞棉塞(或硅胶泡沫塞)，37°C培养。

3、斜面接种：①试管先写上标签，注明菌名，然后将菌种斜面和欲接种斜面试管架在左手虎口之上，用食指和中指夹住试管，大拇指按在两管中央，菌种管口在外方，斜面稍朝上。

②先将棉塞(或塑料帽、硅胶泡沫塞)用右手扭转松动，以利接种时拔出。

③右手拿接种环末端，使其垂直于火焰中，烧红灭菌。

④用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞。

⑤以火焰灼烧管口，烧时应不断转动试管口，使试管口沾染的少量杂菌得以烧死。

⑥将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管。

⑦迅速将接种环在火焰旁伸进欲接种试管，在培养基上轻轻划蛇形线，划线时要由底部到顶部，由下而上，但不要把培养基划破，也不要使菌种污染管壁。

⑧将火焰灼烧试管口，并在火焰旁将塞塞上，塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时污染杂菌。

⑨放回接种环前，将环在火焰上再烧红灭菌。

放下接种环后，再腾出手将棉塞塞紧。

五、放线菌，霉菌的培养1、制备霉菌培养基、放线菌培养基和细菌培养基各5个，在不同位置敞开放置1h ，盖上盖子，倒置。

2、将静置接种的培养基放入恒温培养箱中培养。

六、实验结果1、放线菌，霉菌，细菌形态的观察2、实验图片（斜面接种结果）主要特征 细菌 放线菌 霉菌 菌落主要特征 湿润或较湿润，少数干燥，小而突起或大而平坦干燥或较干燥，小而紧密干燥，大而疏松或大而紧密菌落透明度 透明、半透明或不透明不透明不透明 菌落与培养基结合程度 结合不紧 牢固结合 较牢固结合 菌落颜色 颜色多样 颜色多样 颜色多样，且鲜艳 菌落正反面颜色的差别基本不同 一般不同一般不同（平板划线结果）（穿刺接种结果）(涂布平板结果)（宿舍敞开静置接种1h后培养结果）3、计数计数是根据菌落均匀程度划分若干区域，则每个区域内菌落数乘上区域数即可求出该稀释度的菌液浓度，再除以稀释倍数即可得样品细菌浓度。

我组由于涂布平板未能均匀，菌落离散程度不够，难以准确计数。

七、实验总结与分析①、思考题配制培养基的基本步骤有哪些？应注1.培养基是根据什么原理配成的？牛肉膏、蛋白胨、琼脂在培养基中的不同成分哥起什么作用？答：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，有碳、氢‘氧、氮、磷、硫、钾、钙、钠、镁、铁、等微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。

调整适合的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。

其中的牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，添加琼脂则可以使培养基凝固或半凝固，为培养基里菌落的生长提供支撑介质。

通常加入质量浓度15-20g∕L的琼脂为固体培养基。

意什么问题？答：按配方计算培养基中各种成分的用量→称量→溶化→调pH→灭菌（高压蒸汽灭菌）→倒平板。

3.简述蒸气加压法灭菌的原理和方法。

答：高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

4.分离活性污泥为什么要稀释？答：活性污泥中的微生物种类繁杂，数量庞大。

如果不经稀释就直接培养，则培养基上的菌落会因为数量过多而互相连结，不能得到单一菌落。