● 转染(transfection):指病毒及其重组 子导入受体细胞的过程.
● 转导(transduction):指噬菌体及其重 组子导入受体细胞的过程
第十章基因工程技术育种
转化
(1)氯化钙法
● 1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠 杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克 之后,便能吸收λ噬菌体DNA。1972年 美国斯坦福大学 S.Cohen报道,经氯化 钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA 。
第十章基因工程技术育 种
2020/11/28
第十章基因工程技术育种
• 第一节 基因工程概述
•★1、概念：是指将一种或多种生物体（供体）
的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入 另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意 愿遗传并表达出新的性状。
•也称为DNA重组技术(DNA Recombination) 或分子克隆(Molecular cloning)
•★ • ⑴３从、供基体本细胞过中程分离：出目的基因 (“切”) ；
• ⑵ 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上， 形成DNA重组分子(“接”)；
• ⑶ 借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞 (“转”)；
⑷ 培养转化细胞，以扩增DNA重组分子，使其整合到受 体细胞的基因组中（“增”）；
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•优点
•操作比较简单，是处理 大量的受精卵的理想方法。
•缺点
•缺 点 是 导 入 无 定 向 性 ， 转 移 率较低，针对不同种鱼需要建 立相应的电脉冲条件(脉冲电 压、脉冲时间、脉冲次数、间 隔时间、脉冲介质)等。
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2.3 精子载体导入法
利用精子作为转基因载体，借助受精作用把外源基因导 入受精卵，整合到受精卵的基因组中，是构建转基因动物的 一种新的尝试。
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(2)电穿孔法
电穿孔法(electroporation):是指在一个较大的 电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许 DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜 快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电 穿孔法。
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• 转化子的鉴定 • 转化子的外源基因表达
•3. 穿梭载体
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• DNA连接酶(DNA ligase)
• DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反 应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的 DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物 细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量 来源。
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鱼类转基因技术研究始于淡水鱼。1985年， 我国学者朱作言等人首次报道了转基因鱼试验成 功。他们将小鼠金属硫蛋白启动子-人生长激素基 因组体（mMT-hGH）导入金鱼受精卵中，获得 了第一批转基因鱼。海水鱼类的转基因研究直到 90年代初才有报道，加拿大研究者成功地将海水 鱼的生长激素基因和抗冻蛋白基因导入鲑科鱼类 ，培育出个体较对照鱼30倍的“超级鱼”和能够 表达抗冻蛋白的转基因大西洋鲑。我国
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•★2、诞生：
• 1971年，美国Smith,H.O. 等分离出一种 限制性酶，可酶切病毒的DNA分子； • 1972年：Ｂerg, P. 等实现不同酶切DNA 片段的体外连接； • 1973年：Cohen,s.等将体外重组的DNA 转入大肠杆菌细胞并得以表达。
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• • 第Ⅱ类限制性酶： • 能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链
DNA的特异序列—回纹对称序列。
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• 载体•(vector)
• 一个DNA片段只有与适合的载体DNA 连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下， 才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并 在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。
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2.2 电脉冲法
外源DNA在电脉冲作用下进入受精卵。
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谢岳峰等(1989)以泥鳅脱膜受精卵为材料，电穿孔 转移外源基因，获得了10% 的转基因泥鳅。 Powers(1992)采用电穿孔法和显微注射法，将线性 化DNA 导入斑马鱼、斑鲴和鲤受精卵。电穿孔法产 生的转基因鱼数量比显微法的多。 Zhao(1993)证明电穿孔导入的GH 基因不仅能表达 ，而且还能遗传。 Powers(1992)采用电穿孔法获得的转基因斑马鱼和 鲤的子一代约一半携带外源基因并能有效表达。
修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键
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• 连接多个平头双链DNA分子：
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•目的基因与 载体的连接 (DNA分子重 组)
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重组DNA分子导入宿主细胞
● 转化(transformation):指将质粒DNA 或以它为载体构建的重组质粒导入细菌 中的过程。
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•★ 4. 基因工程的应用
•(一) 基因工程工业 •(二) 植物基因工程 •(三) 转基因动物 •(四) 基因治疗
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•◆胰岛素的人工生产
第十章基因工程技术育种Fra bibliotek •◆植物基因工程
• 根癌农杆菌介导的植物转化
• ◆植物基因转化：是指将外 源基因转移到植物细胞内、 并整合到植物基因组中稳定 遗传和表达的过程。
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2.1.显微注射法
显微注射法是目前最常用的方法，导入外源基 因的成功率也比较高。主要包括两种方式：
(1)卵母细胞的细胞核注射； (2)受精卵的细胞质注射。
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显微注射法的优点是外源基因的导入整 合效率较高，缺点是需要贵重精密仪器，技术 操作难度较大，并且外源基因的整合位点和整 合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因 组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致 死。并且，显微操作处理对鱼类卵子有机械损 伤，受精卵的成活率受到很大影响。
其中，海水养殖的发展尤为迅速。相比贝类和虾 类养殖，海水鱼类的养殖发展较慢。
制约因素较大的是越冬问题，多数海水养殖品种 在4℃以上才能越冬，8 ℃以上才能摄食和维持缓慢 生长。其次海水鱼的遗传育种和全人工繁殖育苗问题 尚未彻底解决，育苗成活率较低。
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根据目前研究现状和发展趋势，海水鱼 类基因工程的研究内容主要为：
研究者在世纪初也将海水鱼生长激素成
功导入我国重要的海水经济鱼类真鲷和
牙鲆，培育出生长速度明显加快的转基
因海鱼群体。
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鱼类作为转基因研究的实验动物，比哺 乳动物等具有更多的优点： ➢鱼类怀卵量大，一次可产几万个至几十 万个； ➢大多数种鱼类的卵子卵径大，卵质透明 ，便于进行显微注射等遗传操作； ➢鱼类是体外受精体外发育，易于进行人 工受精和控制胚胎发育的条件。
➢ 分离和克隆海水鱼类中的有用基因; ➢ 筛选适用海水鱼类基因克隆和表达的载体及表达体系。 ➢ 利用转基因技术，将外源基因导入海水鱼中，培育性状优
良的转基因海水鱼类品系。
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1. 海水鱼类基因的。
几种重要的海水鱼类基因 生长激素基因 抗冻蛋白基因 催乳素基因和生长催乳素基因
•◆可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的
• 重要蛋白质。
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• ◆基因治疗
•◆利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具 有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方 法，通常叫做基因治疗(gene therapy)。 •◆目前最常用的方法是利用病毒DNA作载体，构建 重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组去毒 病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。
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第二节 鱼类基因工程
以鱼类为研究对象，应用基因工程技术于鱼 类遗传育种和海水鱼类资源开发研究的一门 应用性，技术强的分支学科。 本节以海洋鱼类为研究对象进行介绍。
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进入上世纪90年代，我国水产品总量已跃居世界 首位，水产养殖产量超过捕捞产量，水产业的发展由 捕捞型转向增养型。
• ◆根癌农杆菌介导的植物转 化
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•◆转基因动物
•与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。
•◆例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。
•◆将人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶产生相关基
因
• 启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达，
使羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶；
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该法较简单、方便，依靠生理受精过程，免去 了对原核的损伤。通过此法获得的精卵受精和受精 卵成活率几乎不会受到影响。但精子携带基因转移 法仍存在转基因阳性率低、转移率不稳定等缺点。
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目前鱼类的成功报道有6种。 Khoo等(1992)将斑马鱼精子与pUSVCAT质粒在PBS中22℃ 保育30~40 min，得到23.3% (环状质粒DNA)和37.5% (线状 质粒DNA)的阳性率。 Sin等(1993)将大鳞大麻哈鱼的精子与外源基因混合，经电脉 冲处理后再受精，获得5％～10%的转基因阳性率。 于健康等(1994)将金鱼精子与AFP基因在Niu—Twitty液中4 ℃保温30 min后，再与卵子受精，经PCR 法和Southern blot 分子杂交法检查，阳性率为26%。
• 可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、 病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、 YAC）等。
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•★作为载体DNA分子，需具备四个条件： •⑴具复制原点(ori)，能携带的外源DNA片段