第四届“探密生命”实验设计大赛课 题：纳米材料介导的目的基因在肿瘤细胞上的表达负责人：王 璞 生物科学类 2009级组 员：杜 爽 生物科学类 2009级武梦菲 生物科学类 2009级柳善达 生物科学类 2009级崔 桐 生物科学类 2010级一、实验基本构思（一）实验背景在日新月异的今天，肿瘤仍是严重威胁人类健康的重大疾病之一。

目前，其发病率呈逐年上升趋势，2020年全世界癌症（恶性肿瘤）发病率将比现在增加50%，全球每年新增患者人数将达到1500万人。

近20年来，癌症居死亡原因之首，我国的癌症死亡率上升了29%。

所以，如何走出肿瘤治疗的瓶颈，仍需要我们继续探索。

制疗癌症的传统方法有三种：手术治疗，放射治疗及化学治疗。

基因治疗则是近年来兴起的一种新的治疗热点，被认为是治疗恶性肿瘤最有希望的治疗方案之一。

它的基本思路是将正常的遗传物质导入病人的体细胞并使之表达，产生有治疗作用的蛋白质．从而达到治疗疾病的目的。

这种方法直接应对造成疫病的本质——损伤的基因，而不是解决由损伤基因造成的疾病症状，因而有可能从根本上对疾病进行治疗。

而介导目的基因的载体一直是基因治疗研究领域中最至关重要的核心问题之一。

纳米材料自被发现之初就一直备受青睐，近年来将纳米材料分散于聚合物中以提高高分子材料性能的研究也日益活跃，并取得了许多可观的成果。

（二）实验意义随着人们对p53基因与肿瘤发生机制研究的深入，以及对纳米材料性能作用的不断发现，利用纳米材料介导p53基因及其相关因子对肿瘤的预防、治疗将更加有针对性，对人类攻克肿瘤具有重要的参考意义。

然而纳米材料作为基因介导的载体虽具有发展前景，但目前仍有许多未知问题尚待解决。

通过这个实验，可以初步验证纳米材料作为载体介导目的基因（野生型P53基因）在肿瘤细胞中可有效表达。

并通过实验中相关量的对比设置，对纳米材料运用有更一步的认识，提供理论依据。

（三）实验目的1、验证所选纳米材料能否与目的基因结合实现复合——转染的过程，并分析各溶液条件对复合率、转染率的影响。

2、选取标记基因，检测目的基因的转入，并观察目的基因表达部位与数量。

3、设计实验证明目的基因正常表达。

4、观察肿瘤细胞的各项指标，研究肿瘤细胞转染后对肿瘤细胞的抑制作用。

5、整理分析，并与预期进行比较，发现问题，得出结论。

二、实验材料与方法（一）实验材料：1.聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯[PEI—PBLG(10KD)]2.野生型P53基因3、绿色荧光蛋白(GFP)基因4．人宫颈癌细胞株Hela5. 其它材料：DMEM培养基PBS工作液：取贮存液50ml 加三蒸水450ml即成，高压灭菌，4℃保存。

细胞裂解液灭活新鲜小牛血清内切酶BamHI Tris．HC1缓冲液0.8%的琼脂糖凝胶多聚甲醛(粉末状) 中性树胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） SDS缓冲溶液四甲基乙二胺（TEMED）硝酸纤维膜 TBS溶液 P53抗体（小鼠单克隆抗体）二抗（碱性磷酸酶偶联的羊抗小鼠lgG） DAB显色试剂盒0.5%MTT溶液二甲基亚砜胰蛋白酶70%冷乙醇 200目尼龙网碘化丙啶(PI 50ug/l)（二）实验仪器：磁力搅拌器、无菌滤器、Eppendorf管、恒温孵育箱、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、紫外灯、荧光显微镜、基因枪、恒温水浴箱、玻璃研磨器、Mini Trans-Blot的冷却装置、ELC检测试剂盒、Mini-PROTEAN 3、电转移系统、酶联免疫检测仪、流式细胞仪烧杯、1000ml容量瓶、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头、接种板、三角锥瓶、载玻片、盖玻片、夹板盒、底片、压片盒、印记膜（三）实验步骤：1、受体细胞的培养1.1 受体细胞的培养取人宫颈癌细胞株Hela，DMEM培养基加10%灭活小牛血清，培养于37℃、饱和湿度含5% CO2细胞培养箱。

2、野生型P53基因与 PEI—PBLG的复合2.1 实验原理：分子末端带有阳离子的PEI—PBLG，可通过其表面氨基团正电荷与核苷酸分子的磷酸根负电荷发生静电作用，从而，与DNA形成复合物，并导致载体DNA的浓缩。

2.2 实验方法2.2.1 野生型P53基因的提取取含1．8kb p53 C-DNA的pc53．SN质粒,经用内切酶BamHI消化后，获得1．8 kb p53 C-DNA；2.2.2 wtp53/PGFP融合基因的合成运用PCR技术将野生型P53基因进行扩增，利用新型分子探针绿色荧光蛋白基因（GFP），运用基因重组技术与野生型P53基因融合成wtp53/PGFP融合基因；2.2.3 融合基因在无菌管中的培养取三支Eppendorf管，在每管中将1μg wtp53/PGFP融合基因稀释在50μl 不含灭活新鲜小牛血清的DMEM培养基，分别标记上A、B、C，振荡均匀。

2.2.4各条件对复合物形成的影响规定PEI—PBLG与野生型P53基因的质量比分别为0.5/1，1/1，1.5/1，分别加入到标有A、B、C的三个无菌管中，将相对应的无菌管溶液混合。

2.2.5 复合结果的观察与分析室温孵育15min，形成复合物，用0.8%的琼脂糖凝胶100V电泳20min，进行凝胶电泳分析，在紫外灯下鉴定复合结果，并筛选出复合程度最高的一组备用，经酒精沉淀保存。

对观测结果截图并进行分析。

3、外源基因的介导3.1实验原理：PEI—PBLG通过其表面所携带的正电荷阳离子与细胞膜表面带有负电荷的糖蛋白及磷脂结合，以胞吞机制进入细胞质。

3.2实验方法：3.2.1 Hela细胞的接种转染前24h,将Hela细胞以1×104个细胞每孔接种在96板上培养24h，待细胞丰度50％～80％。

在转染前4h，用PBS洗涤1次，用不加灭活新鲜小牛血清的DMEM培养基置换培养液，然后把其吸走。

3.2.2 Hela细胞与复合物的转染每孔加入含有0.2μgwtp53/PGFP融合基因的PEI—PBLG/wtp53复合物和150μl不含灭活新鲜小牛血清的DMEM培养基，在37℃下培养4h。

PBS洗涤2次，加入含10%FCS和抗生素的细胞培养液，在37℃下继续培养20h。

4、目的基因的检测4.1实验原理：GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。

GFP基因与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可检测目的基因是否转染成功，并能定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化。

4.2实验方法4.2.1多聚甲醛溶液的制备取40g多聚甲醛(粉末状)，置于三角锥瓶中，加入 0.1M的PBS（PH=7.4）500ML，将搅拌子同时置入瓶内，用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，【如仍不溶，滴加NaOH,(1N 或0.1N）】，待溶液清晰后停止搅拌，自然冷却后再用PBS调到1000ml，最后调PH至7.4（若时间充裕，可提前1-2天配制，放于37摄氏度水浴箱中，慢慢溶解，以防因温度过高而产生甲醛）4.2.2 GFP基因荧光检测转染后48h,将收获的转染Hela细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗1次， 4％多聚甲醛(PBS 配制)室温固定30min后，风干，PBS洗2次，再风干，用中性树胶封片。

在荧光显微镜下，488nm激发波长下观察绿色荧光的分布和数量，扫描照相存档留作分析材料。

5、Western bolt法分析P53基因的表达5.1实验原理：Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，采用聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳，将蛋白质样品转移到固相载体上。

固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的第一抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

5.2实验方法5.2.1组织蛋白的提取培养转染细胞一段时间后，弃培养基，用PBS漂洗细胞2次，去除残留培养基。

加入SDS样品缓冲液，在冰浴下用玻璃研磨器磨碎标本，然后加入细胞裂解液裂解细胞，转移到无菌管中。

超声波处理10—15秒，煮沸样品5min（蛋白质变性），离心取上清。

5.2.2 SDS-PAGE电泳参照SDS-PAGE电泳方法，配制10%分离胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀并灌胶。

灌胶时，用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出（以免产生气泡），待胶面升到绿带中间线高度时即可，液封，加快凝胶速度。

当水与胶之间有一条折射线时，等3min使胶充分凝固并倒去胶上层，用吸水纸将水吸干。

配制4%浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后把梳子水平插入浓缩胶到中。

浓缩胶凝固，不停向两边补胶，待凝固后，两手分别捏住数字的两边竖直向上轻轻拔出。

用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中。

取组织蛋白上清液为上样，加至0.5ml离心管中，加入SDS上样缓冲液调节浓度。

加入足够电泳液后上样电泳，时间控制在4～5 h，40V。

5.2.3转膜将处理好的胶浸泡于转移缓冲液中平衡10min，选用硝酸纤维膜，依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。

依照海绵/三层滤纸/胶/膜/三层滤纸/海绵的装配顺序制作转移三明治，若有气泡则及时赶去。

将转移槽至于冰浴中，放入三明治（胶放于负极面，黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V。

1h后，切断电源，取出杂交膜。

5.2.4显色反应将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

在1.5ml离心管中，将P53抗体（小鼠单克隆抗体）用TBST以1：30的比例稀释，取适当大小的保鲜膜，四角用水浸湿，将抗体溶液加到保鲜膜上。

取出膜，用滤纸吸取残留液，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。

用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

用1：300的比例稀释二抗（碱性磷酸酶偶联的羊抗小鼠lgG），与膜接触，室温下孵育1～2h。

用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，采用DAB 显色试剂盒检测、摄影，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

6、外源性野生型P53基因对肿瘤细胞的作用探究6.1 MTT法检测肿瘤细胞生长能力6.1.1 调节转染细胞孔内密度并接种6.2流式细胞术检测细胞周期及凋亡重复上述1—4实验步骤，收集转染细胞到流式样品管中，制成两块样板，每个样品测1万个细胞。

用胰酶消化细胞成悬液，加入PBS溶液，离心洗一次（1000rpm），弃上清；70%冷乙醇固定，200目尼龙网过滤，滤液中加入入碘化丙啶(PI 50μg/l),混匀在室温避光放置20分钟；加入适量PBS离心洗一次（1000rpm），弃上清。