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七、亲和层析的应用
1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质
结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理
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酶与底物 (包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子)，抗原与抗体，激素与受体，核酸中的 互补链多糖与蛋白复合体。
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对载体的要求
不溶于水，但高度亲水； 惰性物质，非特异性吸附少； 具有相当量的化学基团可供活化； 理化性质稳定； 机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定
的流速； 通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子
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优缺点
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱 过程简单、快速，是一种理想的有效分离 纯化生物大分子的手段。亲和层析具有高 选择性高活性回收率和高纯度等特点。
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但是亲和层析技术也有一些缺点主要是载 体 (如琼脂糖Sepharose) 价格昂贵机械强 度低 (易压床)配基的制备困难偶联条件激 烈需要使用剧毒的活化剂 (如CNBr)等。
抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和 力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来 说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间。
配体必须有一个适当的化学基团，这个基团不 参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接 支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分 子结合的亲和性。
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适用范围
生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、 抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及 多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等) 的分离和纯化
现代分离技术 -----亲和层析
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概念
亲和层析是利用共价连接有特异配体 的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异 结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析 技术。
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分离原理
亲和层析是一种吸附层析，抗原（或 抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异 性结合，而这种结合在一定的条件下又是 可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后， 就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原） 选择性地结合在固相载体上，借以与液相 中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目 的。
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拟生物亲和层析
拟生物亲和层析是利用部分分子相互 作用模拟生物分子结构或某特定部位以人 工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白 质的亲和层析尤以氨基酸 (包括多肽) 亲和 层析 (AALA) 和染料亲和层析(DAFC) 为代 表染料配基能通过共价键牢固的结合到亲 和载体上由于价格低廉与蛋白质的结合容 量高并且不易为物理或化学物质所降解因 此也是一种较为理想的基团特异性配基。
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免疫亲和层析
免疫亲和层析以抗原抗体中的一方作 为配基亲和吸附另一方的分离系统称为免 疫亲和层析由于抗体与抗原作用具有高度 的专一性并且它们的亲和力极强，所以许 多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经 使用了单克隆抗体 (简称单抗) 作为亲和配 基目前利用抗体抗原模式有可能得到每一 种目标蛋白的单抗然后以单抗为配基通过 亲和层析技术来分离纯化目标蛋白质。
特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗 脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专 一吸附上去的杂蛋白
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常用的解脱剂有0.2mol/LpH2.8甘氨酸 －HC1缓冲液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲 液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸 钾（或钠）、1mol/L乙酸、6mol/L盐酸胍、 0.2mol/LKC1等。作为抗原抗体解脱剂，最 多用的是3mol/L硫氰酸钾（或钠）及 0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液。
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第一步
载体和配体的结合 抗原或抗体结合到支持物上的方法目前
有20多种，但可归结为载体结合法、物理 吸附法、交联法和网络法4类。
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第二步
与目标蛋白结合 配体与目标蛋白发生特异性结合。
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第三步
目标蛋白的洗脱
非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、 介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、 洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅 速恢复到天然结构
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可编辑版Βιβλιοθήκη 类生物亲和层析（BAFC） 免疫亲和层析（IAFC） 金属离子亲和层析（IMAC） 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC）
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生物亲和层析
生物亲和层析是利用自然界中存在的生物 特异性相互作用物质对的亲和层析通常具 有很高的选择性典型的物质对有酶底物酶 抑制剂激素受体等。
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金属离子亲和层析
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合 或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统目 的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基如组氨 酸的咪唑基半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基 十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合这也 是IMAC用于蛋白质分离纯化的唯一依据金属 离子如锌和铜已发现能很好的与组氨酸的咪唑 基及半光氨酸的巯基结合含有不同数量这些基 团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分 离
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将具有特殊结构的亲和分子制成固相 吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋 白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲 和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析 柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被 吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质 分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合 条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
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琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和 色谱的优良载体。琼脂糖凝胶结构开放， 通过性好，酸碱处理时相当稳定，物理性 能也好。琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件 下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐，并 能在温和的条件下与氨基等基团作用而引 入配体
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对配体的要求
抗原或抗体必须单一特异性：抗原或抗体的纯 化效果决定于固相中配体的纯度。
能自由通过； 能抵抗微生物和醇的作用。
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可以做为载体的有皂土、玻璃微球、 石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰 胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素 和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微 球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸 附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙烯酰 胺凝胶是目前的首选优良载体。