Western-Blot操作流程
试剂配制
1.RIPA裂解液：
10mM Tris（MW121.14，PH7.5）
1%NP40
0.5%TritonX-100
0.2%脱氧胆酸钠
2 mM EDTA
1 mM PMSF
20%甘油
调pH值至7.5。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。

使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。

制胶用（1-6）：
1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）
Tris (MW121.14) 12.114g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。

2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 18.671g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。

3.10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

4.10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）
5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。

6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。

10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml
30%丙烯酰胺 5ml
1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml
10%SDS 150μl
10%AP 150μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。

灌胶后加异丙醇（1ml）消泡
5%上层胶（两块胶，6ml）：
依次加入去离子水 4.1ml
30%丙烯酰胺 1ml
1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml
10%SDS 60μl
10%AP 60μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。

7．5X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14） 15.1g
甘氨酸（MW75.07） 94g
SDS 5.00g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。

8．10X转膜缓冲液
甘氨酸（MW75.07） 151.1g
Tris（MW121.14） 30.3g
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。

通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。

（先加甲醇易产生沉淀）9．10XTBS缓冲液
Tris（MW121.14） 24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏水至 1000ml
（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。

10．1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液 100ml
蒸馏水 900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。

溶解后室温保存。

11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
1XTBST缓冲液 95-100 ml
脱脂奶粉 5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。

步骤：
SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2、按前面方法配12％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在7ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶后胶上加
一层异丙醇醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。

3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

弃去异丙醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。

4、等待胶凝期间可计算含10-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）
取出上样样品至EP管中，加入5×上样缓冲液至终浓度均为1×。

上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。

5、按前面方法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插
入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。

等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。

6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。

7、上样
Marker 7μl
样本根据自己的样品决定
实验所用Thermo 26619# Marker电泳后出现9条带：10，15，25，35，55，70，100，130，250KDa（具体条带数目会因为胶的浓度不同而不同），最少4条带（6%的分离胶时出现70，100，130，250KDa）。

（3）电泳：开始恒压，电压80V，电泳跑到分离胶以后可调节电压到120V
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。

电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。

（四）转膜
（1）转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。

切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。

将切好的硝酸纤维素膜现在甲醇中浸泡激活，后和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。

（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-PVDF膜-2张滤纸-海绵（顺序一定注意）
将夹子打开使黑的一面保持水平。

在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

在垫子上垫二层滤纸，先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。

在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。

最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。

要不断的擀去气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。

（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。

电转移时会产热，故放冰来降温。

一般用恒流400mA转膜1.5-2h。

✧实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应
样本。

转膜后，膜要分正反面，转膜时靠胶的一面为正面。

转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。

如果做磷酸化抗体等，需要用血清封闭，具体情况可参考抗体说明书。

（五）免疫反应
（1）封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1-2h。

（2）一抗
. 将一抗用封闭液稀释至适当浓度；加入抗体， 4度过夜，次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。

（3）二抗
同上方法准备二抗稀释液，室温下孵育1-2h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂等量等体积混合；
打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将膜正面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）
（2）将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中；
在红灯下
✧取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；把X－光片放在膜上，一旦放上，便不
能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不
同时间多次压片，以达最佳效果；
✧曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；
✧显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，
从而节约定影液）。

定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；
✧。