进修生日志：primer BLAST在线设计引物扩增未知菌种
兰会华1整理屈平华2审校
1广西壮族自治区人民医院检验科，
2广东省中医院检验科
PCR的第一步就是引物设计。

引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。

引物设计的软件很多，但是，多数时候是引物设计出来了，PCR也能扩增到目的条带，但非特异性的条带好几条，甚至比目的条带还要亮的，郁闷的有木有？再有，分离到一个新菌种，要扩增管家基因或蛋白基因，可引用参考文献的引物，却怎么也扩增不出来，泪奔的有木有？小编在这里给大家介绍利用细菌的全基因组序列，以primer BLAST在线设计引物和PCR扩增新菌种的方法，让您找到高大上的感觉。

一、实验目的：设计属特异性引物PCR扩增一未知菌弗朗西斯菌的sdhA基因
二、引物设计过程
（一）获得目的基因序列
1、进入NCBI，点击gemone，搜索待扩增菌的属名Francisella
2、点击search，结果得了相关菌种的全基因组序列。

2、点击其中的一个全基因组，如“广州弗朗西斯菌”
4. 全基因组1658482 bp，这么大。

人海茫茫，该如何找到sdhA？
这时，可使用网页搜索功能，按热键Ctrl+F，再输入要查找基因名称“sdhA”，如上图。

然后，就找到sdhA基因了。

请看，sdhA基因的位置在全基因组的第174351..176144之间哦（见下图）。

5. 再点击左侧的gene（上图），就得到了广州弗朗西斯菌1741bp的sdhA基因全序列，text文本保存。

（二）序列拼接，获得合并序列
如果要扩增的是一个已知的菌种，如广州弗朗西斯菌，那么，只要得到上面的引物，你就可以直接去设计引物了。

但如果要扩增的是一个未知菌种呢？1个序列可不够；总之，你的序列得尽可能多，而且是完全不同的序列尽可能多；最好是弗朗西斯菌属内所有的已知的sdhA基因，甚至是与弗朗西斯菌亲缘关系相对较近的军团菌的sdhA基因当然，军团菌没有sdhA基因，这是后话。

小编最终只找了弗朗西斯菌属内8个sdhA基因。

DNAMAN软件进行了序列拼接，Sequence，Sequence Assembly，加载序列文件。

当然，为了防止序列差异过大，应该适当修改参数，如Identity 90%，应该修改为80%，甚至70%。

拼接后的序列，有除A、G、C、T外，还有Y、R、W等兼并碱基什么的。

对了，要的就是这个结果。

（三）primer BLAST 设计引物
1、百度搜索Blast网站，或网页直接打开/Blast.cgi，点击Primer-BLAST进入引物设计。

2、在把目的序列粘贴到框内。

3、引物的特异性验证的参数设置：primer BLAST 设计引物的最大优势，就是选择物种名称进行引物的特异性验证。

引物的特异性验证的参数设置方法见上面，根据我们的目的，在Database一栏，选择了Genome(chromosomes from all organisms)，在Organism一栏中，选择了Francisella（见下图）。

4、点击“Get Primers”按钮，将显示所有与含目的基因序列相近的全基因组和菌株。

鉴于我们的目的是扩增一未知菌弗朗西斯菌的sdhA基因，为PCR增加成功的可能性，自然是勾选“All”（见下图）。

5、然后，然后，引物就设计好了……给我们设计了10条呢！
看看引物的特异性吧，土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）挺不错，引物序列完全匹配，蜃楼弗朗西斯菌（Francisella philomiragia）就不那么乐观了，当初真应该把全部48个已公布全基因组菌种的sdhA基因都找出来啊。

三、实验结果
第1次的引物设计不太完美，但意想不到的是，居然还是成功地扩增到所需的目的片段，经基因测序验证，也确实是sdhA基因。

只能说，我们太幸运了。

四、小结：
设计PCR引物扩增一个已知菌种且已知序列的靶基因，应该没什么难度。

但如果要设计一个属特异性的引物，用于该属未知菌种的PCR扩增，还是需要那么一点点技巧和运气。

因为引物设计受靶基因序列的长度、碱基排列顺序和不同菌种序列的差异程度等多种因素的影响，所以并不是每一个靶基因都能设计出能扩增整个菌属的属特异性的引物。

故有时候，我们需要退而求其次，要么换一个更保守一点的基因（如管家基因）作为靶基因；要么找一个或几个与待测菌种亲缘关系接近菌种的靶序列来进行设计引物；只求能扩增到靶基因，而不必追求能设计出适合属内所有菌种的属特异性引物。

在我们的这些引物设计中，虽然在线的特异性验证结果并不完美，但最终仍然成功地扩增到靶基因，主要原因在于，该属内的多个菌种已经测序了全基因组，并且，与待菌株亲缘关系密切的广州弗朗西斯菌也测序了全基因组。

五、参考文献：
Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.[J]. Bmc Bioinformatics, 2012, 13(6):: 134.。