· 489 ·《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００８，２８（４）●　技术与方法文章编号： １０００－１３３６（２００８）04－0489-03ＤＮＡ甲基化分析方法肖正中 邬苏晓（韶关学院英东生物工程学院，韶关　５１２００５）摘要：ＤＮＡ甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一。

甲基化分析的方法多且研究难度大，各种方法都有其一定的优势和不足。

本文综述了基因组ＤＮＡ甲基化和特定ＤＮＡ片段甲基化状态分析方法新进展，为研究者提供参考。

关键词：ＤＮＡ甲基化；ＣｐＧ岛；表观遗传学中图分类号：Ｑ３３４收稿日期：２００８－０４－１２作者简介：肖正中（１９７２－），男，博士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｚｚｗｓｘ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；邬苏晓（１９７２－），女，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｗａ４０３５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍＤＮＡ甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。

甲基化通常发生在胞嘧啶的Ｃ５位，形成５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ），甲基化的胞嘧啶多位于ＣｐＧ岛上。

ＣｐＧ岛是ＣｐＧ二联核苷富集区域，ＣＧ含量大于５０％，长约２００￣５００　ｂｐ。

哺乳动物ＤＮＡ甲基化的模式只有５ｍＣ这一形式，真核生物中大约２％￣７％的胞嘧啶被甲基化修饰。

１． 基因组ＤＮＡ甲基化分析方法早期的基因组ＤＮＡ甲基化分析技术，如ＳｓｓＩ甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已不能满足现代表观遗传学研究的需求。

近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。

１．１　甲基化敏感扩增多态性技术 甲基化敏感扩增多态性（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＭＳＡＰ）技术由Ｒｅｙｎａ－ｌóｐｅｚ等报道，并被用于检测双相型真菌的ＤＮＡ甲基化［１］，它　是在扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，　ＡＦＬＰ）技术的基础上建立起来的。

其基本程序是：提取高质量基因组ＤＮＡ，分别用ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ，ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ两组酶组合对基因组ＤＮＡ进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行ＰＣＲ扩增。

扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次ＰＣＲ扩增，扩增产物变性后在６％的序列胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析ＤＮＡ条带。

这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用［２－６］。

ＭＳＡＰ技术相对其他测定ＤＮＡ甲基化程度的技术有如下优点：（１）不需知道被测ＤＮＡ的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于ＤＮＡ序列背景知识未知的生物。

（２）操作相对简便，在ＡＦＬＰ技术体系的基础无需改进，即可操作。

（３）可在全基因组范围检测ＣＣＧＧ位点的胞嘧啶甲基化变化。

ＭＳＡＰ技术的局限性在于不能完成非ＣＣＧＧ位点的胞嘧啶甲基化。

１．２　高效液相层析及相关方法 高效液相层析（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，　ＨＰＬＣ）能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将ＤＮＡ样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算５ｍＣ／（５ｍＣ＋５Ｃ）的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。

Ｆｒａｇａ等［７］运用高效毛细管电泳法（ｈｉｇｈ　ｐｅｒ－ｆｏｒｍａｎｃｅ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　ＨＰＣＥ）处理ＤＮＡ水解产物确定５ｍＣ的水平，相比ＨＰＬＣ，ＨＰＣＥ更简便、快速、经济。

ＨＰＬＣ及ＨＰＣＥ测定基因组整体ＤＮＡ甲基化水平的敏感性均较高。

２． 特定ＤＮＡ片段甲基化检测方法２．１　亚硫酸氢盐预处理法 （１）甲基化特异性ＰＣＲ。

甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳＰ）是Ｈｅｒｍａｎ等［８］首先提出的一种检测基因组ＤＮＡ甲基化水平的常用方法。

该法是将ＤＮＡ经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。

在ＰＣＲ反应· 490 ·《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００８，２８（４）●Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化ＤＮＡ链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化ＤＮＡ链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。

两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的ＤＮＡ序列无互补配对。

ＭＳＰ引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的ＣｐＧ岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中ＣｐＧ岛所占比例越高，甲基化ＤＮＡ检出率越高。

该法不足之处在于：引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对ＤＮＡ处理不完全，也易导致假阳性。

可通过限制性内切酶酶解法检验ＰＣＲ产物作进一步判断。

（２）变性高效液相色谱法。

Ｏｅｆｎｅｒ等［９］提出变性高效液相层析（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ＨＰＬＣ，　ＤＨＰＬＣ）用于单核苷酸和ＤＮＡ分析。

邓大君等［１０］将该法改进并与ＰＣＲ联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的ＤＮＡ产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留，因此在随后的ＰＣＲ扩增时，其变性温度也相应上升，使ＰＣＲ产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列甲基化状况。

（３）联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。

联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法（ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｂｉｓｕｌｆｉｔｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　ＣＯＢＲＡ）原理：先对样本ＤＮＡ行亚硫酸氢钠处理后，ＰＣＲ扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含ＣＧ序列，如ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）。

若其识别序列中的Ｃ发生完全甲基化（５ｍＣＧ５ｍＣＧ），则ＰＣＲ扩增后保留为ＣＧＣＧ，ＢｓｔＵ　Ｉ能够识别并进行切割；若待测序列中，Ｃ未发生甲基化，则ＰＣＲ后转变为ＴＧＴＧ，ＢｓｔＵＩ识别位点丢失，不能进行切割。

这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例［１１］。

Ｂｒｅｎａ等［１２］联用ＣＯＢＲＡ和Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ对酶切产物进行直接分析，使ＣＯＢＲＡ的定量更快速、准确且无放射性污染。

该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道ＣｐＧ位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。

缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品ＤＮＡ中甲基化存在的可能；由于酶和ＰＣＲ的使用，序列分析受到限制。

（４）甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法。

甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）可用于快速判断ＤＮＡ片段中某些具体位点的甲基化状况［１３］。

其原理：样本ＤＮＡ经亚硫酸氢钠修饰，ＰＣＲ扩增目的片段，产物电泳分离后作为Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ模板。

分别针对所检测的ＣｐＧ位点设计上游引物，使３＇－端引物紧邻Ｃ。

然后将模板、引物、Ｔａｑ酶及３２Ｐ标记的ｄＮＴＰ混合，进行单核苷酸延伸反应。

若所检测的ＣｐＧ位点发生甲基化，则３２Ｐ标记的Ｃ掺入到ＰＣＲ产物中；反之，未甲基化掺入的则为Ｔ。

再电泳分离产物，成像。

根据某一ＣｐＧ位点的Ｃ／Ｔ信号强度比，可定量其甲基化程度。

也可不经电泳，ＰＣＲ产物直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个ＣｐＧ位点的平均甲基化程度［１４］。

Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ可快速定量多个ＣｐＧ位点的甲基化程度，但它不能对较长的序列进行全面的考察，且检测多个ＣｐＧ位点时，需设计较多的引物。

２．２　联合甲基化敏感的限制性内切酶法 （１）甲基化敏感的限制性内切酶ＰＣＲ。

甲基化敏感的限制性内切酶ＰＣＲ（ＭＳＲＥ－ＰＣＲ）原理为：基因组ＤＮＡ经甲基化敏感内切酶广泛消化后，再设计与所选基因特异性匹配的引物，经多重ＰＣＲ扩增（未被切割的片段不被识别），即可同时、快速检测多基因的ＤＮＡ甲基化状态［１５］。

该法用很小量的ＤＮＡ标本即可检测多基因的甲基化状态，且可用于异质性标本，提示其可被进一步发展成为高通量的临床样本分析方法。

（２）　ＣＯＭＰＡＲＥ－ＭＳ。

Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等［１６］报道了将ＭＢＤ柱层析法与甲基化敏感的限制性内切酶法（ＭＳ－ＲＥ）联用的ＣＯＭＰＡＲＥ－ＭＳ，能快速、敏感地检测ＤＮＡ甲基化情况，可用于临床标本检测，作为早期诊断和肿瘤分级的方法学工具。

其过程是：用内切酶切取待测片段，再用甲基化敏感的限制性内切酶消化，消化产物经ＭＢＤ柱捕获含有甲基化区的片段，最后通过实时ＰＣＲ扩增进行定量分析。

这种方法联合运用了ＭＢＤ柱层法及ＭＳ－ＲＥ法，避免了单用ＭＢＤ引起的非特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所致的假阳性。

此法简便、快速、特异、敏感。

缺点是需要使用限制性内切酶，因此不同程度· 491 ·《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００８，２８（４）●　技术与方法地受到内切酶识别位点的限制。

２．３　探针杂交法 （１）甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法。

甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法（ＭＳ－ＭＬＰＡ）法是根据ＭＬＰＡ技术发展起来的。

其原理是：首先，应用ＭＳ－ＭＬＰＡ探针（探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏感的酶限制位点）和标本ＤＮＡ进行杂交使之结合形成ＤＮＡ－探针复合物，并用连接酶将探针连接，然后，ＤＮＡ－探针复合物与甲基化敏感的限制性内切酶结合并被消化，最后进行ＰＣＲ扩增、电泳。

如果这个ＤＮＡ标本的ＣｐＧ位点被甲基化，一个ＭＬＰＡ产物将会被检测到；如果这个位点没有被甲基化，则这个复合物将被消化而不会产生产物［１７］。

该方法敏感、高效，与目前常用的甲基化检测方法相比具有以下优点：只需要极微量ＤＮＡ标本就可以一次检测多种基因的甲基化水平；简便易行，可进行批量检测；ＭＬＰＡ可以进行定量检测；可用于石蜡包埋标本的检测。

（２）　ＤＮＡ微阵列法。

Ｙａｎ等［１８］将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于ＤＮＡ甲基化检测中，极大的提高了检测的效率。

ＤＮＡ微阵列，　又称ＤＮＡ芯片或基因芯片，是基于杂交的寡核苷酸微阵列法产生的，是一种在基因组中寻找新位点的方法，包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化（ＤＭＨ）杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性的微阵列（ＭＳＯ）。

前者类似于ｍＲＮＡ表达谱或ｃＤＮＡ微阵列，是ＣｐＧ岛微阵列；后者类似于寡核苷酸微阵列，是针对ＣｐＧ二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列。