第九章 外源基因在真核 细胞中的表达
一、选择标记和报告基因 二、DNA 直接导入的基因转化方法 三、农杆菌作载体的植物转基因方法 四、外源基因转化在基因表达调控研究中的应用 五、反义RNA及其在基因表达调控中的作用 六、 RNA干扰
一、选择标记和报告基因
真核生物细胞中的选择标记
在将外源目的基因转化真核细胞时，必须分辨 出哪些细胞被转化了，哪些细胞没有被转化。将一 个选择标记与外源目的基因连接，被转化的细胞就 带有选择标记。选择标记常用抗生素抗性基因，真 核生物细胞所用的抗生素与原核细胞有所不同。
聚乙二醇诱导基因转化
受体细胞处于M期最好，因此时无核膜， 能提高转化率。加入运载体DNA也能够促进转 化，运载体DNA常用小牛胸腺DNA或鲑鱼精子 DNA，要求剪切成5～13kb大小。剪切可用注射 器来回吸注DNA溶液几次，然后通过电泳检测 剪切效果。
高压电穿孔法
在电击时加入PEG和运载体DNA可提高 转化率。 高电压短时间举例：5 KV 180μS 低电压长时间举例：300V 10~20min
花粉管通道法
将外源DNA与花粉混合涂于已去雄的柱头上， 使之沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊， 转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子及早期的胚 胎细胞。由于这一方法技术简单，一般育种工作 者易于掌握，故有一定的价值和应用前景。
利用载体导入外源DNA
1 植物病毒载体感染植物细胞法 2 农杆菌介导的 Ti 质粒载体转化植物细胞法 3 动物病毒载体感染动物细胞法
绿色荧光蛋白
The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
二、DNA直接导入的
基因转化方法
1 聚乙二醇法 2 高压电穿孔法 3 显微注射法 4 基因枪法 5磷酸钙共沉淀法
6 脂质体介导法 7 激光微束穿孔法 8 超声波介导法 9 DEAE-葡聚糖法 10 原生质体融合法
聚乙二醇诱导基因转化
外源DNA加聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）和二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）可 在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的 内吞作用导入细胞。用多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸 代替PEG也行，二价阳离子常用CaCl2或MgCl2。 植物细胞必须除去细胞壁，可用纤维素酶降解细 胞壁，在等渗溶液中分离得到原生质体。
β-葡糖醛酸糖苷酶基因
β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS） 是目 前 应用 最 广泛 的 报告 基 因之 一 。它 以x-gluc （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖醛酸）为底物，催化产 生蓝色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝沉淀，可用来观察 转化基因的组织化学定位。还可以4-MUG（4-甲基 伞形酮葡糖苷酸）为底物，催化产生4-甲基伞形酮， 产物用荧光分光光度计测定，此法可测定基因表达 的强度。
冠瘿碱的检测方法
精氨酸、胭脂碱、章鱼碱三种物质的电泳迁移 率不同，精氨酸的最大，章鱼碱和胭脂碱的接近， 电泳1小时以上可将二者分开，章鱼碱的迁移率略 大于胭脂碱。
有时因细胞内缺乏冠瘿碱合成的底物，导致假 阴性结果。可在提取液中加入精氨酸，保温一段时 间后再检测冠瘿碱。
报告基因之五
绿色荧光蛋白基因
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
二 氢 叶 酸 还 原 酶 （ dihydrofolate reductase, DHFR）对于真核细胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合 成是必需的。对营养缺陷型dhfr－ 细胞来说，二 氢叶酸还原酶基因可用作选择标记，在缺少胸腺 嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中筛选出转化了的 细胞。
脂质体载体法
脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分 子层组成的小球，DNA包裹在脂质体中，通过融合 或吞噬作用被细胞吸收。转化脂（lipofectin）主要 是由具有强正电荷的N-[1-(2,3-二油酰)丙酰] N,N,N三甲氨盐酸盐（ DOTMA ）和二油酰磷脂酰乙醇胺 （ DOPE ） 组 成 的 小 单 层 脂 质 体 SUV 。 借 助 于 DOTMA的强正电荷，可以与带负电荷的DNA分子 自发地结合，只要把转化脂与DNA简单地混合，即 可形成转化脂与DNA的复合物，把DNA包埋在脂质 体内，并可有效地转化动植物细胞。这种转化脂已 有商品出售。
选择标记之三
新霉素磷酸转移酶基因
新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ neomycin phosphotransferase Ⅱgene, nptⅡ）是一个来源于转座子Tn5 编码的分子量为25KD的酶，它催化许多氨基糖苷类 抗生素（如新霉素、庆大霉素、卡那霉素、G-418） 的磷酸化反应，将ATP上的γ磷酸基团转移到抗生素 分子上，阻止了它们与靶位点——核糖体的相互作 用，从而使这些抗生素失去对细胞的毒性。这类抗 生素的毒理作用是与叶绿体及线粒体核糖体的30S亚 基结合，阻止70S核糖体形成。
报告基因之二
氯霉素乙酰基转移酶基因
CAT也能用作报告基因。用14C标记的氯 霉素、乙酰CoA与细胞、组织提取物反应，薄 层层析法分离反应产物，放射自显影可测得 CAT活性。
氯霉素的结构式
2,2-二氯-N-(1R,2R)-1,3二羟基-1-(4硝基苯基) 丙-2-基乙酰胺
氯霉素催化的反应及检测方法
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
氨甲喋呤（methotrexate, MTX）和三甲氧 苄二氨嘧啶（trimethoprim）是二氢叶酸类似物， 是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，当培养基中 含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生 长受到抑制。有一种突变的DHFR，它不受MTX 的抑制，以它作选择标记，转化的细胞可在含 MTX的培养基上生长。
绿 色 荧 光 蛋 白 （ green fluorescent protein ，
GFP）基因取自维多利亚水母Aequorea victoria，广
泛应用于细菌、酵母、动物和植物中。GFP在受到 395nm紫外光或490nm蓝光照射时，会发出509nm 的绿色荧光。因为GFP不是酶，检测时不需要加底 物，且没有毒性，所以可以用于活体检测。
选择标记之四
潮霉素磷酸转移酶基因
潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去 毒性。潮霉素B可抑制核糖体的功能，使细胞 不能合成蛋白质，因此对大多数植物和动物细 胞均有毒性。
选择标记之五
氯霉素乙酰转移酶基因
氯霉素能抑制真核细胞线粒体中的蛋白 质合成，而氯霉素乙酰转移酶 （chloramphenicol acetyltransferase，CAT） 能使氯霉素乙酰化，从而失去毒性。
报告基因之三
荧光素酶基因
荧光素酶（luciferase，LUX）基因取自荧 火虫或发光细菌，在ATP和Mg2+存在下，催化 荧光素氧化发光。可用发光光度计测定。
报告基因之四
冠瘿碱合成酶基因
冠瘿碱合成酶是农杆菌Ti质粒上T-DNA区编码的 一类与冠瘿碱（如章鱼碱、胭脂碱、农杆碱、农瘿碱、 琥珀碱、甘露碱）合成有关的酶。从转化的细胞中提 取冠瘿碱，纸上电泳后用菲醌染色，紫外光下检测黄 色荧光，根据冠瘿碱的有无和多少，可知冠瘿碱合成 酶的表达情况。
用硅胶G薄层层析可以分离和分析乙酰化的PPT，
从而测定PPT乙酰转移酶的活性，所以pat基因也可
以当作报告基因。
报告基因
报告基因（reporter gene）可用于研究基 因调控和转化基因的表达情况。报告基因一般 是一种酶的基因，对报告基因的要求是在受体 细胞中没有其产物，产物容易检测。
报告基因之一
GFP的性质
GFP是由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分 子量为26,888Da，其产生荧光的发色团是由Ser65， 脱氢Tyr66，Gly67自身环化及氧化形成，形成时需 要氧，不需要酶催化。野生型GFP发射的荧光强度 较弱，人们通过突变来提高GFP的荧光强度，有实 验表明，当GFP S65T 的Ser65突变为Thr时，在转化 的BOSC23细胞中荧光强度比野生型增强18倍。
高压放电
基因枪工作原理图
点火装置
火药子弹 电极 水滴
塑料子弹 载片
微粒
档板 靶组织
火药爆炸
磷酸钙沉淀法
将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液， 逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形 成DNA－磷酸钙共沉淀复合物。然后用吸管将沉 淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细 胞可将复合物吸收到细胞内，保温几小时后，用 新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养液继续培养， 直至外源基因高水平表达。转化率在10%左右。
下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出 绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光 蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色 荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时 追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
激光微束穿孔法
一定波长的激光束经聚焦后到达细胞表面时 其直径大约只有0.5～0.7μ m，这种直径很小但能 量很高的激光微束可引起膜的可逆性穿孔。具体 做法是：在荧光显微镜下找到适当的细胞，然后 用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束 脉冲，细胞壁被击穿，DNA分子随之进入细胞。 由于激光孔径小，为线粒体、叶绿体的遗传工程 以及细胞质遗传的研究提供了方便的手段。

显微注射法
显微注射法（microinjection）采用显微操 作系统、毛细管注射。常用于动物受精卵细胞 的转化，也可用于植物原生质体的转化。此法 的关键是受体细胞的固定，受体细胞常被固定 在微吸管上，或固定在琼脂中。