分子生物学实验
（1）琼脂糖凝胶电泳进行DNA分离原理
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。

DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。

最前沿的是SCDNA,其后依次是L DNA和OC DNA
EB（溴化乙锭）的作用是染色剂，可以插入到DNA的双链中，在紫外线的作用下，会发出白光
电泳缓冲液的PH在6~9之间，离子强度0.02~0.05最合适，琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，。

（2）SDS法提取植物基因组DNA的原理
利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55~65度）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

（3）DNA回收试剂盒回收DNA原理
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段．可得到大小一致的DNA片段。

先使凝胶被溶胶液溶解，然后DNA与HiBindTM DNA柱子结合，再从HiBindTM DNA柱子中洗脱出DNA片段。

HiBindTM DNA柱子可以在某种适宜的情况下高效而可逆地结合DNA/RNA，除去蛋白质及其他杂质，而被结合的核酸能很容易地被去离子水或低盐缓冲液洗脱出来。

（4）利用PCR扩增目的基因原理
利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的扩人工复制，在很短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

（5）目的DNA片段的T载体连接及阳性重组子氨芐青霉素抗性筛选的原理
1.T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

2.氨苄青霉素抗性插入失活筛选法先将转化液涂布含有Amp的平板；再将Amp平板上的转化子影印至含有Tet的平板上；在Amp平板上生长、但在Tet 平板上不长的转化子即含有目的重组子。

将外源DNA片段插在EcoRI位点，则：非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tetr 将外源DNA片段插在BamHI 位点，则：非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tets 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。

原理：
氨苄青霉素筛选原理：一般阳性重组子中都含有氨苄青霉素抗性基因，放在含有氨苄青霉素的培养基上培养，如果含有外源DNA，那么细胞内就有载体，载体上有抗性基因，能够对抗生素具有抗性，因此能生长，而如果细胞内没有外源基因，也就没有载体上的抗性基因，不能表达，从而在抗生素培养基上长不起来
常用的筛选重组体的杂交方法有1、菌落和噬菌斑原位杂交2、斑点印迹杂交3、R-环检测4、Southern印迹杂交5、Northern印迹杂交1、原位杂交筛选2、斑点印迹杂交3、R-环检测法4、Southern印迹杂交Southern （6）大肠杆菌热激转化原理
实验原理:
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。

热激法:大肠杆菌在0C、CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，与转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。

在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子
实验步骤:
(1)从-80 °C冰箱内取- -管冻存的感受态大肠杆菌DH-5a于冰浴上融化复苏10min;
(2)加入待转化的质粒0.5μL-1.5μL，轻轻吹打混匀，冰浴30min;
(3)在42 °C恒温水浴锅中严格操作热激90 s然后立即冰浴静置2 min
(4)在无菌操作台内，向感受态大肠杆菌中加入600 μL-1000μLLB液体培养
基，在200r/min、37°C恒温摇床内摇30min-1h进行活化;
(5)在活化的时候，从4C拿出含抗生素的固体细菌培养板放到37"C恒温培养箱中回温十分钟。

(6)活化结束后，在无菌操作台内，吸取菌液20μL-40μL涂板到含抗生素(50 mg/ml)的固体细菌培养板上;
(7)置于37 C恒温培养箱内过夜培养(12h-16h)。

要点:
1，固体培养板的抗生素抗性(Amp，Kana)
2，转化质粒的量根据质粒浓度进行添加
3，涂板菌液的量根据活化加培养基的量进行选择
4，注意每项工作前都要进行充分准备，比如涂板棒进行灭菌，移液枪进行消毒等。

5，对刚连接的质粒进行转化，不同之处在于活化时间为1-2h。

活化后，将菌液2500 -3500rpm离心3 min, 留下沉淀和200μL菌液，充分混匀，涂板到含抗生素的固体培养基上。

7，离心机和移液枪的使用和注意事项
移液器操作规范和使用注意事项:量程：0,5~10ul,20~200ul,100~1000ul
1.设定移液体积
从大量程调节至小量程为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可
从小量程调节至大量程时,应先调至超过设定体积刻度,再回调至设定体积，这样可以保证移液器的精确度
2.装配移液枪头
将移液枪垂直插入吸头，左右旋转半圈，上紧即可。

用移液器撞击吸头的方法是非常不可取的，长期这样操作回导致移液器的零件因撞击而松散，严重会导致调节刻度的旋钮卡住
3.吸液及放液
垂直吸液
吸头尖端浸入液面3mm以下，吸液前枪头先在液体中预润洗
慢吸慢放
放液时如果量很小则应吸头尖端可靠容器内壁
4.吸有液体的移液枪不应平放，枪头内的液体很容易污染枪内部而可能导致枪的弹簧生锈
5.移液枪在每次实验后应将刻度调至最大，让弹簧回复原型以延长移液枪的使用寿命
6.吸取液体时--定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。

7.为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留--层”液膜”，造成排液量偏小而产生误差。

8.浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。

9.可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器,1mL蒸
馏水20C时重0. 9982g.
10在设置量程时，请注意旋转到所需量程数字清清楚楚在显示窗中，所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。

11.移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体( 如浓酸、浓碱、有机物等)12.严禁使用移液器吹打混匀液体。

13.不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度。

同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作。

1、离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配并要求有良好的接地线。

2、开机前应检查机腔有无异物掉入。

3、样品应预先平衡使用离心机微量离心时，离心套管与样品应同时平衡。

4、挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管,并确保液体不外漏以免侵蚀机腔或造成事故。

5、每次操作完毕，应做好使用情况记录，应定期对机器各项性能进行检修。

6、离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。

7、定期清洁机腔。

8、使用离心机时遵守左右手分开原则，只以右手操作仪器。

9、使用冷冻离心机时，除注意以上各项外，还应注意擦拭机腔的动作要轻柔,以免损坏机腔内温度敏感器。

离心机的使用步骤:
1、离心前用天平保证离心管的绝对平衡。

2.打开电源歼关，离心机自检后,开启盖门。

3、选择所需转头,用扳手安装转头,松紧适当。