山羊基因克隆实验方案设计第五组1.提取DNA2.DNA检测（电泳）3.目的DNA片段基因扩增（PCR）4.DNA检测（电泳）5.目的基因片段与载体连接6.大肠杆菌感受态细胞的制备7.导入受体细胞与蓝白斑筛选8.阳性克隆鉴定9.DNA测序一、DNA提取【实验目的】指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。

【实验原理】组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。

【实验步骤】1. ＜30 mg组织，用眼科剪剪碎，加入200 TL buffer＋20 μL PK，55℃水浴1-3 h。

2. 加入220 μL buffer BL，振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液变清亮。

3. 10000 r离心2 min，移上清液至新离心管。

4. 加220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，可能会出现絮状沉淀。

5. 将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000 r离心30 s，弃废液。

6. 向吸附柱加入500 μL WB，12000 r离心30 s，弃废液。

7. 向吸附柱加入500 μL wash buffer，12000 r 离心30 s，弃废液，空滤一次。

8. 将吸附柱转入干净离心管，加入50 μL TE，放置5 min，12000 r离心2 min，备检。

二、DNA电泳检测【实验原理】琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。

凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。

琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。

琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。

它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。

根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。

借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。

【仪器与试剂】琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）、凝胶槽、电泳仪【实验步骤】1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。

2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。

3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。

4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。

5．DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。

6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。

7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA 带之间）。

8．电泳完毕关闭电源。

将凝胶放紫外灯下观察并拍照。

三、目的DNA片段基因扩增（PCR）方案1：遗传学实验31，PCR扩增基因片段方案2：【实验目的】了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。

【实验原理】PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。

这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。

PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。

PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。

置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。

由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过Innis M·A 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

图3-1 PCR原理示意图PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。

不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。

1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。

虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。

2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。

（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。

（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。

（3）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。

（4）引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。

（5）引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。

3、缓冲液：PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCl2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP 的浓度为0.2mM时），浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量降低。

四种dNTP 浓度通常每种都是0.05mM—0.2mM。

过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。

四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。

另外dNTP 能与Mg 2+结合，使游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP 的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变。

Taq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是1—4 单位/100ul，浓度过高，产生过多的非特异片段。

4、循环参数：PCR 循环是把起始材料加热到90—95℃，保持短时间使双链DNA 解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退火；再升温至70—75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。

解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。

用DNA 扩增仪时，94℃保持1 min可使模板的起始物完全变性。

若用低于94℃的条件，则应适当延长时间。

引物与模板退火温度由引物的长度及G+C含量决定。

适时间退火（1—2）min 有利于产物的特异性。

引物延伸在70—75℃保温的时间可根据扩增DNA片段的长短来调节。

正常情况下，每min可延伸1Kb 的长度，常规PCR 一般为25—40 个循环，若循环加长，则由于酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易产生错误掺入，所以在满足产物得率前提下，应尽量减少周期次数。

【仪器与试剂】（一）仪器与器皿PRC 扩增仪（PE2400），琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪,玻片（二）试剂与材料琼脂糖凝胶电泳试剂：1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA；2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖；3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水；4）琼脂糖、TaqDNA 多聚酶、5′反应缓冲液：125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4；Formamide 25%、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2mmol/L)、DNA 模板（每2′ml 中含有10fg 待扩增DNA）、引物1 （25 pmol/L），5’加入EcoRI 粘性末端碱基、引物2 （25 pmol/L），5’加入HindIII 粘性末端碱基、无菌水【实验步骤】1. 按顺序在200ml 指形管中加入以下试剂与样品。

（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。

总体积共100ml，也可以配成40ml 的反应体系）表3-1 PCR所用试剂样品及其用量试剂及样品用量/mLddH2O7410′Buffer10 MgCl2（10′Buffer 如已加入MgCl2，则不必加）6dNTP 2引物1 2引物2 2模板 2Taq DNA聚合酶 22. 在PCR 扩增仪上按表3-2反应条件编入程序（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定）。

表3-2 PCR反应参数条件循环条件（30次）预变性变性复性延伸温度94 ℃94 ℃55 ℃55 ℃时间 2 min 40 s 35 s 2 min 10 s 3．延长延伸72 ℃7 min编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。

4. PCR 扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15ml 反应液及相适应的PCR mark 分别点样，加样缓冲液应为40%W/V 蔗糖，电泳观察结果。

5. 凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA 片段。

四、DNA电泳检测（具体方案见实验2）五、目的基因片段与载体连接【实验原理】克隆载体（T载体）：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+ 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。