耐药率高： 48万新发的MDR-TB病例和10万耐利福平结核病（RR-TB） 病例；
接受MDR检测、报告和治疗的MDR-TB不足1/3，接受治疗的MDR-TB 治愈成功率只有50%
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2015年全球估计MDR-TB患者数
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结核病快速及时诊断是结核病防控 重要因素
平和异烟肼的传统药敏试验
可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）
推荐理由: •在我国获得注册证书； •国内研究显示其敏感性和特异性较好； •民族品牌 •数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；
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探针熔解曲线技术
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工作原理
在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定， 当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。
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根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
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异烟肼耐药突变检测体系示意图
通过检测 katG315、inhA 启动子和、ahpC 启动子区、inhA94 、密码子的突变
与2否02确0/1定1/1样4 品对异烟肼的耐药性。
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根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
靶序列扩增曲线：
内参扩增曲线：
不同标本的内参扩增结果一致，显示纯化后的DNA溶液对扩增无抑制。
高纯度模板DNA是分子检测可靠性的关键！
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临床试验结果
此外，在北京胸科医院、广州胸科医院、沈阳胸科医院、乌鲁木齐胸科 医院、山东省胸科医院、河南省CDC、厦门市CDC等单位进行临床应 用或验证，均获得满意结果。
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对新型耐药检测技术的要求
操作简便 检测时间短
闭管检测
检测位点全面
灵敏准确
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基因芯片技术
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结核病耐药与基因
异烟肼
50-70% kat G基因突变 5-10% inh A基因突变 6-13% ahp C基因启动子区域突 变
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ΔTm
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利福平耐药突变检测体系示意图
❖ 96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区域内
根2据020靶/11序/1列4 熔点的变化，检测rpoB基因 是否含有突变，获得利福平耐药信息 24
根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
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阿米卡星>95% 卡那霉素>85% 卷曲霉素 70~80% 紫霉素<10%
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基因芯片（原理）
基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药 性相关的rpoB/katG/inhA的基因位点发生突变，通过PCR 扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描 ，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和结核 菌耐药性。
利福平
95% rpo B基因突变
耐药 基因
70% 65% 93% 95%
链霉素
64-68% rps L 基因突变
乙胺丁醇
70% emb B基因突变
多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸
突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产
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在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。
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结核病和非结核的诊断
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特点
标本：菌株、涂阳痰标本 时间：约8小时 优点：高通量 灵敏度、特异度高
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国家结核病参比实验室推荐建议
基因芯片可以用于: 可疑耐药结核病患者筛查,它有望代替利福
95% 70%-90% 75%-95%
链霉素
rpsL43, rpsL88, rrs513~517, rrs905~908 位点的突变
70%-90%
氟喹诺酮
gyrA88~94 内任意突变
70%-90%
注射类二线药
rrs 基因 1401、1402、1473、1484 位点以及 eis 基因启动子 区-37、-14、-13、-10 位点
2生02耐0/1药1/14
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抗结核药物 检测位点
突变覆盖率
利福平 异烟肼 乙胺丁醇
rpoB507~533 之间(81bp)内任意突变 ahpC 启动子区（-44 ~ -30 以及-15 ~ 3 位点）， inh94 密码子， inhA 启动子区（-17 ~ -8 位点）以及 katG315 密码子 embB306,368,378,380,406,497 密码子突变
步骤二
加入1-96个提取样本到 检测管中
步骤三
集成多重PCR和结果自动报告
总耗时约3小时，手工操作时间约15分钟
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（一）DNA提取
～40 min
高质量的样本DNA
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（三）PCR过程和自动判读
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痰标本纯化DNA qPCR 检测结果
样品制备仪 杂交仪 激光共焦扫描仪 软件判读
基因芯片仪和试剂获国12 家SFDA和欧盟CE认证
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基因芯片法
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利福平的耐药位点
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同时鉴定MTC与21种NTM
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非结核分枝杆菌
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耐药结核病诊断新技术
• 主要内容
• 一、概述 • 二、基因芯片技术 • 三、熔解曲线技术
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2016年全球结核病报告
全球范围内结核病疫情严重 患病率高： 新发患者1040万/年，其中有120万（11%）HIV患者；
死亡率高：每年死亡人数达140万（13.46%），HIV/TB:死亡人数40万 （33.33%）；
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根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
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链霉素
乙胺丁醇
氟喹诺酮
每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的熔点, 软件可以自动地给出 突变类型,即使发生不均一突变的情况,也可以分辨出来.
2020/11/1431操作流程步一自动提取1-24份样本