植物细胞工程的基本技术
目标：1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。

2、尝试进行植物组织培养。

重点：1、植物组织培养的原理和过程
2、植物体细胞杂交的原则
难点：植物组织培养的实验
教学内容：
一、细胞工程
1．概念：应用和的原理和方法，通过或上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的或获得的一门综合科学技术。

2．分类：根据操作对象不同，可分为、。

二、植物细胞的全能性
1、植物细胞主要的增殖方式是，细胞分化是指，__________________________________________________________________原因是_____________________ 。

2、全能性是指，表现为全能性的原因是__________________________________________________。

三、植物组织培养技术
1．原理：植物细胞具有，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成
的潜能。

2．过程
离体植物的
−
−→
−脱分化 _ 组织−
−→
−再分化幼根和芽或胚状体−
−→
−发育
完整植株。

(1)细胞脱分化：已的细胞经过诱导后，失去其特有的而转变成未分化细胞的过程。

(2)愈伤组织特点：
3．植物组织培养：在和的条件下，将的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生、丛芽，最终形成完整植株。

四、胡萝卜的组织培养
1、实验原理
生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都具有发育成完整个体的潜能。

因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成。

将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成。

2、实验步骤
①．将用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。

用酒精棉球擦手。

②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3 ( ) 次。

③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。

然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成 1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。

左右的小块。

④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。

然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。

⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。

4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。

然后，在恒温箱中继续避光培养。

在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。

⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。

然后将试管苗移栽到大田，培养成 。

3、注意事项
⑴．外植体的选择与制备
①选择外植体时，由于外植体的脱分化难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而有很大差异，因此，选择哪些作为外植体应该注意。

一般来讲，烟草、胡萝卜，植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶和成熟的老组织则较难。

②制备外植体首先要消毒，其次要选取有形成层的部分，因形成层细胞易脱分化。

⑵．植物组织培养注意的要点
①培养基包括所有操作工具都应进行消毒和灭菌，谨防杂菌污染。

②需在无菌条件下操作。

③接种，继代培养的转移都应在接种箱内进行。

⑶．对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。

但在由高度分化的组织形成愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养，而在分化形成试管苗的再生的过程中一定要有光照。

诱导形成愈伤组织阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。

由愈伤组织经细胞有丝分裂和分化形成试管苗的过程中需要光照，原因是叶中叶绿素的合成需要光照条件。

五、植物体细胞杂交技术
1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。

2．过程
离体的细胞果胶酶
纤维素酶−−−→−不同细胞原生质体−−−→−人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。

3．植物体细胞杂交步骤：
(1)去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用纤维素酶、果胶酶去除植物细胞的细胞壁。

(2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过物理法和化学法来诱导融合。

物理方法有：离心、振动、电激等促使原生质体融合。

化学法是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂来诱导融合。

融合后再生出细胞壁。

(3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。

如图
在此过程中需要注意的问题有：
①植物体细胞杂交过程中，植物细胞融合所依据的生物学原理是细胞膜的流动性；植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。

②体细胞融合成功以后，既有AB型杂种细胞，还能形成AA型和BB型两种融合细胞，但只有AB型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞，因此在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。

③目前常用的去除细胞壁的方法是酶解法，保证了原生质体活性。

植物体细胞杂交完成的标志是新细胞壁的形成。

④植物体细胞杂交过程仍以植物组织培养为前提，通过植物组织培养完成杂种植株的培育过程。

⑤植物体细胞
杂交的最大突破是克服远缘杂交不亲和的障碍，但是目前仍有许多理论和技术问题没有解决，离推广应用仍有一定距离。