需要载体，目 因表达水平； 整合在生殖 因的单个拷 的基因的长度 可以使用定 细胞中的比 贝； 可达100Kb 点整合技术 例也很高。
该方法简 单、方便
缺 精密仪器， 供体细胞易 ES细胞株不 插入的基因 应用 有些结果
点 技术操作较难，衰老
易建立，长 有大小限度； 具有 不能重复
易造成宿主动
期培养后出 嵌合性很高； 一定
转基因小鼠技术
---转基因小鼠的构建
李懿萍
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基因打靶的简易程序
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胚胎干细胞（ES细胞）法
优点：
外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、
表达的水平及插入的稳定性
外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛
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6、YAC法（人工酵母染色体法）
优点：
克隆百万碱基对(Mbp) 级的大片段外源DNA 的能力,可以保 证巨大基因的完整性; 保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变; 保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高; 鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或 减弱基因整合的位置效率。 缺点： 不稳定，制备工艺繁琐。
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小鼠的历史
10. 1953年 -- DNA双螺旋
Crick，Watson和Wilkins三人因为这项 杰出的成就荣获了1962年的诺贝尔奖。
11. 1966年 -- 遗传密码破译
Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破 译了遗传密码---1968年的诺贝尔奖
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3、逆转录病毒感染法
优点 由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的 高度整合特性, 大大提高基因转移的效率 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中 扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体 缺点 获得纯合体的转基因动物的机会少 病毒载体构建复杂 转入的外源基因的大小受到限制, <10kb 转入病毒自身基因的复制表达
基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；
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基因工程定向育种
向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达， 能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种 之间遗传物质的交换。
实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其 精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异， 从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。
23. 2002年8月 -- 小鼠基因组物理图谱
24. 2002年12月 -- 小鼠基因组
小鼠基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组序列草图， 并且同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为 2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有 40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小 鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组 成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN 基因组科学实验室 的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。
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转基因小鼠技术
---转基因小鼠在科研中的应用
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小鼠的历史
1. 7500万－1.25亿年前 -- 人鼠始祖
2. 19世纪 -- 宠物鼠---实验鼠的“先驱” 3. 1897年 -- 重组表型
白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性
接近天然产品； ⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖
生产群体。
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转基因动物生物反应器研制
乳腺组织特异表的基因：具milk box保守序列
----乳清蛋白基因
----b乳球蛋白基因
----酪蛋白基因
已开发的产物：
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4、体细胞核移植法
优点
减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那 些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。
事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛 选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力, 具有很大的优越性。
缺点
体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基 础理论和实验技术上还需进一步探索。
----血栓治疗药物（组织型纤溶酶原激活因子)
----出血性疾病（凝血因子VIII，IX）
----免疫治疗药物（IFN，IL，TNF）
----营养制剂(人乳铁蛋白）
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人类疾病小鼠模型与基因治疗
癌症---肺癌---p53功能缺陷 遗传病---地中海贫血（临床失败---细胞表达？） AD
染色体定位；
可稳定遗传，易于操作。BAC：基因组酶切后100～300kbDNA+BAC大肠杆
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基因转移方法的比较
方 显微注射 法
核移植
胚胎干细胞 逆转录病毒 基因 精子介导 敲除
优 外源基因整合 转基因效率 外源DNA的 可在整合点 点 效率较高，不 高；预测基 整合率高； 整合转移基
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小鼠的历史
4. 1900年 -- 从宠物鼠到实验鼠
Abbie Lathrop----饲养宠物鼠 1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传 学研究。哈佛大学---老鼠的毛色进行观察，以检测 孟德尔法则的正确性。
5. 1905年 -- 孟德尔老鼠
物基因组的插
现分化现象； 外源DNA 在 局限
入突变
生产的转基 动物各种组 性
因动物都是 织中的分布
嵌合体
不均
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Electroporation
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7. 1916年 -- 肿瘤易受性和组织相容性
Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不 会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。
Jackson实验室的George Snell在1940年代发现了组织相容性基因---荣 获了1980年的诺贝尔奖
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5、精子载体法
将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能 力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植, 这样产生的动物也会使外源基因得到表达。
精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法
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5、精子载体法
优点 基因转化方法简便,效率高 动物育种不经过嵌合体,实验周期短 缺点 目的基因整合的随机性 无法早期验证修饰事件 成功率不高、效果不稳定
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7、BAC法（人工细菌染色体法）
建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可>300kb。
F因子（F质粒Βιβλιοθήκη 是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。 100分析（借助标记loxp和cre
重组酶；
BAC载体两端有Sp6和T7 引物序列利于测序，确定基因的
14. 1982年 -- 转基因小鼠
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小鼠的历史
15. 1983年 -- PCR
Kary Mullis --1993年的诺贝尔奖
16. 1987-89年 -- 第一只基因敲除小鼠
Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几 个研究小组--- 2001获得了Lasker奖
20. 2001年2月 -- 人类基因组
21. 2001年6月 -- 散弹法
美国公司Celera Genomics 使用散弹法测得了 用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一 次性测得基因组全序列的技术。
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小鼠的历史
22. 2002年5月 -- 16号染色体与已被分析的人类 21号染色体序列高度相似
转基因羊、猪、鸡、鱼、鼠等
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转基因动物生物反应器研制
转基因动物生物反应器概念：
将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入 动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外 源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些 组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基 因产物。
乳腺---理想器官
选方便 缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
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3、逆转录病毒感染法
主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域 具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR 下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒, 去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基 因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。
17. 1996年 -- “百慕大法则”
公共基因组序列数据
18. 1998年 -- 克隆鼠