南京大学生物技术系实验报告题目放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察【一、实验目的】1、通过菌落及细胞形态的观察和比较，掌握区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的要点。

2、掌握观察放线菌孢子的方法。

3、掌握观察霉菌孢子及根霉假根的方法。

4、了解酵母菌子囊孢子形成的方法。

【二、实验原理】1、三类微生物菌落形态特征：霉菌形态比细菌、酵母菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。

霉菌营养体的基本形态单位是菌丝，包括有隔菌丝和无隔菌丝。

营养菌丝分布在营养基质的内部，气生菌丝伸展到空气中。

营养菌丝体除基本结构以外，有的霉菌还有一些特化形态，例如假根、匍匐菌丝、吸器等。

霉菌的繁殖体不仅包括无性繁殖体，例如分生孢子，孢子囊等，包裹其内或附着其上的有各类无性孢子；还包括有性繁殖结构，例如子囊果，其内形成有性孢子。

在观察时要注意细胞的大小，菌丝构造和繁殖方式。

放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。

放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。

孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。

孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。

它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。

酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明且分化，个体比细菌大得多。

酵母菌的形态通常有球状、卵园状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。

酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生掷孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。

酵母菌母细胞在一系列的芽殖后，如果长大的子细胞与母细胞并不分离，就会形成藕节状的假菌丝。

2、三点接种法与霉菌菌落形态的观察霉菌的菌落形态是分类鉴定的重要依据。

为便于观察，通常用接种针挑取极少量霉菌孢子点接于平板中央，使其形成单个菌落；或在平板上接三点，即在等边三角形的三个顶点上接种，经培养后同一菌种可形成三个重复的单菌落。

后一方法称为三点接种法。

其优点不仅可同时获得三个重复菌落，还由于在三个彼此相邻的菌落间会形成一个菌丝生长较稀疏且较透明的狭窄区域，在该区域内的气生菌丝仅分化出数子实器官，因此直接将培炎皿放低倍镜下就可观察到子实体的形态特征，从而省略了制片的麻烦，并避免了由于制片而破坏子实体自然着生状态的弊端。

3、微培养微培养是研究丝状真菌、放线菌等微生物生长繁殖全过程的有效方法。

其基本原理是将丝状菌的孢子（或菌体）接种在载玻片的小块薄层培养基上，并盖上盖玻片，且轻压上，使接种后的琼脂块成薄圆片状，造成一个让微生物仅能在载玻片和盖玻片的狭窄空间内横向伸展的生镜，因而在培养过程中，可随时用显微镜观察孢子的萌发，菌丝的生长及孢子的形成等各阶段，亦不会因观察而造成培养标本片的污染。

用此法制备的镜检标本其视野清晰，形态逼真，是显微镜摄影之好材料。

4、插片法培养放线菌放线菌是抗生素的最重要产生菌，其形态特征是军中选育和分类的重要依据。

插片法原理是：在接种过放线菌的琼脂平板上，由于插上盖玻片或在平板上开槽后再搭上盖玻片，使放线菌的菌丝体沿着培养给予盖玻片的交界线上生长，蔓延，从而附着在盖玻片上。

待培养物成熟轻轻取出盖玻片，就能获得放线菌在自然生长状态下的标本。

若将其置于载玻片上即可镜检观察到放下面的个体形态特征。

5、盖片法培养热假丝酵母假丝酵母是以菌体细胞接种，因菌体细胞较湿粘而不易分散，应先加培养基，使凝固后再将菌体接种到表面，然后盖上盖玻片。

【三、实验材料、主要仪器和试剂】1、材料(菌种)：黑根霉、产黄青霉、曲霉、放线菌(链霉菌)、热带假丝酵母菌各培养物，PDA培养基，高氏一号培养基2、试剂：乳酚油溶液、美蓝染液3、仪器：接种环(×1)、酒精灯(×1)、载玻片(×5)、光学显微镜(×1)【四、操作步骤】1、放线菌的形态观察（1）肉眼观察取放线菌的平皿培养物，仔细观察菌落(即孢子堆)的颜色，基内菌丝(即菌落反面)的颜色，可溶性色素(即渗入培养基内的)的颜色，菌落表面的形状(崎岖、褶皱或平滑，有无同心环)菌落的大小，最后用接种耳去触试菌落的硬度。

把你观察的结果记录下来。

（2）显微镜观察观察孢子丝(插片法)。

将放线菌接种到含葡萄糖天门冬素培养基的平皿中，用刮刀均匀。

用插片法把无菌盖玻片斜插在琼脂内。

置于28℃温度箱内培养7～10天。

取出插片法的载玻片，在高倍镜下观察，注意孢子丝的形状(直形、波曲形或螺旋形)、是否轮生。

观察孢子(印片法)用一片盖玻片在链霉菌菌落表面轻轻按一下，即成印片。

在载玻片上放一滴美蓝染液。

将印孢子的盖玻片直接放在美蓝液上，使孢子着色，用吸水纸吸取多余的染液。

用油境观察孢子的形状。

记录观察到的孢子丝及孢子的各种性状。

2、酵母菌的形态观察（1）肉眼观察取酵母的平皿培养物及斜面培养物，仔细观察菌落的颜色、透明度、隆起情况、大小。

记录你所观察到的结果，与细菌菌落加以比较。

（2）显微镜观察取清洁载玻片一块，滴上一滴生理盐水。

用接种耳取酵母斜面培养物少许，放在水中轻轻和匀。

盖上清洁盖玻片一块，注意不要产生气泡。

置于低倍镜、高倍镜下观察，注意细胞的形态、大小、有无芽体。

绘细胞图。

有些酵母菌能形成假菌丝，取下上述盖玻片，在清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，盖上上述盖玻片，把带菌的一面贴在载玻片上，高倍镜下观察是否形成假菌丝。

3、霉菌的形态观察（1）肉眼观察取根霉、产黄青霉、曲霉的培养物各一皿，仔细观察菌落的颜色、质地，用接种耳触其坚度，与放线菌菌落加以比较。

记录观察结果。

（2）显微镜观察在载玻片中央滴一滴乳酸油。

用尖头镊子从根霉菌菌落边缘取出一小块很薄的带菌丝的培养基，放在载玻片上的乳酚油中。

加盖玻片用低倍镜、高倍镜观察。

用同样方法观察产黄青霉、曲霉。

分别绘出三种霉菌的结构图。

根霉假根的观察：菌丝经培养已倒挂成须状，不少菌丝已接触到载玻片，并分化出假根。

取出载玻片，在菌丝上滴一滴乳酚油，盖上盖玻片后，在显微镜下能观察到清晰的假根与葡萄菌丝。

4、清理器皿、实验桌面。

【五、实验结果】3、图片(除示意图外，插图均为用三星P30数码相机在实验过程中拍摄)酵母菌菌落酵母菌细胞酵母菌示意图放线菌菌落放线菌细胞放线菌示意图产黄青霉菌落产黄青霉细胞产黄青霉示意图黑曲霉培养皿黑曲霉细胞黑曲霉示意图根霉培养皿根霉细胞根霉示意图4、镜检（1）盖片法培养酵母菌在10倍镜下观察时，视野中的酵母如同长叶子的枝条状。

后用40倍镜观察。

可以清晰地看到酵母菌的枝条实际上是一个个分省的出芽细胞，像菌丝但实际不是菌丝，故得名假菌丝。

从菌落中挑取一点于一滴蒸馏水中，继续观察，可以看到正在出芽生殖的酵母菌。

其中有的正在分裂，有的已经分裂。

（2）插片法培养放线菌放线菌呈细长线状，分布很密，交错纵横。

中间的腔呈透明。

40倍镜下观察结构，由于使用美蓝，所以视野中呈蓝色。

仔细观察可以发现：放线菌长有基内根，在培养基中；培养基上不是气生根，从气生根又分出许多孢子丝，呈节状，一节为一个孢子；孢子丝顶端一般会盘旋呈螺旋状；同时还有些散落的孢子。

故孢子丝并不牢固，其中的孢子很容易就掉下来。

（3）三点接种①产黄青霉：显微镜产黄青霉为草绿色，40倍镜下形状类似扫帚，分生孢子像糖葫芦长在顶端易脱落，故视野中有大量散落的孢子。

②黑曲霉：在显微镜下观察到黑色的菌丝。

若制片是挑得太少，则会破坏其结构只观察到孢子链，因此挑取一块，其有厚度，可放在10倍镜下观察，逐渐改变焦距可分别清晰地观察到各层次的结构。

有的具有初生小柄，有的不具有。

③黑霉菌：在显微镜下可以观察到棕色的根霉菌丝，其中的孢子束柄为中空的，由匍匐霉菌丝，并观察到假根。

有的孢子囊已被其中凝固的孢子散落在周围。

（4）微培养我们组微培养用的材料是曲霉，由于培养基加的较少，水也较少，所以没有观察到生长。

用其它组培养的根霉载片观察形态同上面的根霉。

【六、实验讨论】1、该实验的注意事项有以下一些：（1）三点接种对有几点要注意：接种时应使平板尽量垂直于桌面，以防接种针上的孢子散落到平板的其它区域或空气中的微生物落到培养基上引起污染；接种时针要垂直于平板，轻点一下即可，切勿刺破培养基；产黄青霉和曲霉要注意其分生孢子穗结构、黑根霉注意孢囊和孢子以及假根和匍匐菌丝结构。

（2）在微培养时，由于我们组的培养基加的较少，且水也较少，所以没有看到曲霉的生长。

故在微培养时，要加入适量培养基和水，接种菌量宜少，同时，盖片和载片间的空间宜窄，但不可无缝隙，尽量使微生物能在狭窄空间里水平生长，利于观察。

（3）放线菌的生长速度较慢，培养其较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。

（4）若酵母生长旺盛，形成密集的一片难以观察，应在边缘寻找合适的视野，再换高倍镜观察。

同时，也可挑取少量酵母域蒸馏水滴中，稀释观察。

2、在我们实验中，酵母培养基上长了一片根霉，可能是接种时被污染了，用接种针挑取去根霉，发现盖片下酵母长得仍然很旺盛，也观察到了其出芽生殖，可见根霉由于其易生长性，可以同酵母一同生长。

3、在实验中我们发现霉菌的孢子囊和分生孢子都是易脱落的，所以在挑取菌时要轻，否则可能观察不到孢子囊和像糖葫芦的分生孢子长在顶端，而只会看到大片的孢子。