支原体检测试剂盒使用说明书
1.试剂：支原体检测试剂盒由武汉源深生物科技有限公司提供。

2.实验方法:
巢式PCR的方法检测支原体污染：
A.待检细胞汇合率在90％以上时取100 µL细胞上清液到离心管内
B.95o C孵育5分钟
C.短暂高速离心15秒钟左右
D.试剂盒里的组份：
引物混合物(Primer Mix) 20 µL
阳性对照DNA (Positive Control DNA) 15 µL
阴性对照(Internal Control DNA) 20 µL
巢式PCR一共需要做2轮PCR，本检测方法不受其他来源（如所培养细胞）DNA的影响，不但提高了检测的灵敏度，同时也提高了特异性。

(1)第一轮PCR:
PCR 混合物：
向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，
盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。

E.热循环程序：
将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序。

PCR 混合物：
向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，
盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。

F. 热循环程序：
将准备好的PCR 管放入PCR 仪，运行如下程序。

试验结果：
2％ 琼脂糖凝胶电泳，TBE 缓冲液，PCR 产物及Marker 均点样10µL ，于50V 下电泳1hr ，EB 染色15min ，紫外灯下观察。

电泳结果见下图：
图中泳道M 为DNA Marker ，1和2为待检测细胞系的第一轮PCR 产物 (1st )，3和4为待检测细胞系的第二轮PCR 产物 (2nd ), 其中1、3为阳性对照管PCR 产物，2、4为阴性对照PCR 产物。

阳性对照管在200bp 左右，和300-400 bp 处各有一条带，证明本次实验准确可靠 (不同的支原体Mycoplasma, such as M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. arthritidis, M. hyopneumoniae and Acholeplasma laidlawii 的保守区的片段长度不一，大概在200-400 bp 之间)。

M 1 2 3 4。