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PCR-VNTR
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生物芯片技术


九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术， 引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种 微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载 体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析 单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细 胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。 基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列 阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过 与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸 序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因， 实现生物基因信息的大规模检测。
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3、多重PCR
在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果 这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的 区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增 多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子 的缺失，或在检测缺失设置内对照。

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4.RT-PCR

RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作 用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平） 迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高 mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与 调控的研究。
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过 程
PCR-SSCP过程：
原 理
DAN
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 4 自显影 ↓ 结果分析
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2. 巢式PCR（nest PCR）
此时也是进行二步PCR，与上面不同的 是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应 用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初 级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板， 进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异 的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提 高了最终产物的特异ction,PCR）
PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚 合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技 术。 体外程序化的DNA合成技术。

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PCR
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原
理：
1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补 的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片 段的长度； 2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶， buffer 3）反应程序： 变性94~95oC 复性 延伸 37~55 oC 70~72 oC 72 oC延伸10min DNA扩增100万倍
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DNA分析中常用的多态性标记有3类：
1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一 代多态性标记； 2）重复序列多态性：短串联重复序列 （STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核 苷酸的差别，为第三代多态性标记。
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一、序列多态（或点多态）



限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或 新的酶切点出现，从而引起不同个体的 DNA在用同 一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种 由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为 RFLP。 RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有 用的遗传标记。
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Allele II 产生了新的酶切点
12Kb
Allele I
8Kb 4Kb
12Kb 8Kb
Allele II probe
RFLP—Southern blot检测结果
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AlleleII酶切位点消失
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二、序列长度多态性（或数目变异串联重复， variable number tendom repeats, VNTR） 重复序列以各自的核心序列（重复单元）， 首尾相连多次重复，称为串联重复序列。 散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式 形成多态。如图： VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之 间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不 同长度的片段。
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解链 构像
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1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
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第二节

DNA多态
DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA 是不完全相同的，一般每100～500bp就有一 个是不相同的，它们多位于内含子序列中， 表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。常 用做遗传分析中的标记。 除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA 是完全相同的。
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RT-PCR
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RT-PCR
cDNA
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五、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）


是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差 异，这种差异将造成相同或相近长度的单链 DNA 电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基 的替代，微小的缺失或插入的检测。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行 PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯 酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的 DNA 构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出 判断。

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VNTR 酶切，电泳后的检测结果
大
小
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PCR-VNTR检测
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通常，重复单位16～28bp长，称为小 卫星DNA。 重复单位２～6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。 DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检 出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, AmpFLP）
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PCR扩增
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PCR特点及应用：
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速； 2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
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PCR相关技术：
1.增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两 个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增， 消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对 于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的 引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物 二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增， 只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后 补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增， 靶序列的产量将相应增加。