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方法实验中采用长 30cm 、内径 25L m 的未涂层熔融石英毛细管 , 利用血红蛋白在 415nm 波长处的特异性吸收峰 , 二极管阵列 (PDA 检测。
结果在 8分钟内完成整个实验 , HbA 1C 和非 HbA 1C 成功分离 , 峰型清晰锐利 , 且能对 Hb A 1C 进行定量分析。
结论该法高效、快速、重复性好 , 具有一定的推广应用价值。
关键词 :毛细管 ; 电泳 ; 糖化血红蛋白 (HbA 1C 中图分类号 :Q503; R446. 11+2 文献标识码 :ARapid detection of hemoglobin A 1C by capillary electrophoresis system Z HENG Hui -f ei, WANG H ui -min, CONG H ui, et al. (Laboratory Medical Center o f Affiliated H ospital o f N anton g University , Public H ea lth Institute o f Nantong Unive rsity , N antong 226001, ChinaAbstract:Objective To establish the method of assaying the hemoglobin A 1C (HbA 1C by capillary electrophoresis system and investigate the clinical si gni ficance. Methods An uncoated fused silica capillary column, 30cm long and 25L m in diameter was used. Based on a specific absorption of the hemoglobin at 415n m, the quanti ty of HbA1c was detected with photo diode array (PDA. Results The assay was finished within 8min. The peaks of HbA 1C and non -HbA 1C could be separated thoroughly. The quantitative analysis of HbA1c was also achieved. C onclusion Being efficient, rapid and reproducible, this method is suitable for clinical use.Key words:Electrophoresis; capillary; hemoglobin A 1C (HbA1C(Chin J Lab Diagn, 2009, 13:0738糖化血红蛋白 (Hemoglobin A 1C , HbA 1C 是指血液中红细胞内与葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。
当血液中葡萄糖浓度较高时 , 人体所形成的 HbA 1C 含量也会相对较高。
人体内红细胞的生命周期为 120天 , 在细胞衰亡前 , 血液中 HbA 1C 含量也会保持相对不变。
由于红细胞不断生存 , 也不断死亡 , 所以 , HbA 1C 水平反映的是近 2-3个月的平均血糖水平 , 而与抽血时间、病人是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。
早在2002年 , 美国糖尿病协会 (AmericanDiabetes Association, ADA 已将 HbA 1C 作为监测糖尿病血糖控制的金标准 , 对其应用也做出了明确的规定 :即所有糖尿病患者均应常规检测 HbA 1C , 其初诊时测定结果为基线时的代谢状况 , 此后的测定值则作为糖尿病长期治疗控制中的一部分。
目前 , 以毛细管作为分离通道 , 高压电场为驱动力的毛细管电泳法已广泛用于分离小分子、手性分子、核酸、蛋白质甚至单细胞 [1], 分离效率高、重复性738 Chin J Lab Diagn, June, 2009, Vol 13, No. 6好。
因此 , 我们开展了利用毛细管电泳法对 HbA 1C 进行的检测 , 现报道如下。
1材料与方法1. 1原理在酸性条件下 , 通过高压电场的作用 , HbA 1C 与电泳缓冲液中带阴电荷的分子结合力较非 HbA 1C 弱 , HbA 1C 和非 HbA 1C 分离 [2], 利用二极管阵列(Photo Diode Array, PDA 在 415nm 波长处检测血红蛋白的吸收峰。
1. 2标本来源南通大学附属医院健康体检正常人和临床确诊的糖尿病人。
标本收集时间 :2008年 5月 -7月。
1. 3试剂与仪器1. 3. 1试剂 HbA 1C C E 试剂盒 , 购自美国 Beckman -Coulter 公司。
1. 3. 2仪器毛细管电泳仪 (P/ACEMDQ Capillary Elec trophoresis System , 购自美国 Beckman -Coulter 公司 ; 未涂层熔融石英毛细管 (25L m 内径、 30c m 长度、有效长度 10cm , 购自河北永年锐沣色谱器件公司。
1. 4方法1. 4. 1标本准备取 ED TA -K2抗凝全血标本 80 L l, 加溶血剂 (hemolyzer 240L l, 用微量加样器充分混匀。
1. 4. 2电泳方法紫外检测波长为 415nm, 反向检测 , 毛细管温度为 26e 。
毛细管先用引发剂 (initia -tor, pH 4. 6 15psi 冲洗 1min, 此步骤是利用 initiator 中含有的多聚阳离子对毛细管内壁进行动态涂层 ; 后用缓冲液 (buffer pH 4. 6 15psi 预冲洗 1. 5min, 使管壁进一步涂层 , 这样的双涂层可以确保电渗流的重复性并减少蛋白吸附。
电压 5kV 进样 6s 后 , 2psi post injection buffer 冲洗 10s, 清洗毛细管进样端口的外壁并将样品往靠近检测口端推移。
电泳分离在 22kv 下进行 3 min, 分离完毕后 , 用 0. 2mol/L NaOH 分别 60psi 冲洗 1min 以及 20psi 和 200L A 电流冲洗 0.75min, 以清除动态涂层并清洁毛细管。
整个实验过程共 7. 7 min 。
2结果2. 1将正常人和糖尿病人血样品按上述条件进行电泳分离 , HbA 1C 与非 HbA 1C 成功分离 , 且峰型清晰锐利 , 与文献报道 [1]及试剂盒厂商提供电泳图谱一致。
正常人血样品见图 1, 其中 HbA 1C /HbA0= 41 9117%, 与报道中 HbA 1C /HbA0参考值范围均相符。
图 1正常人 HbA 1C 毛细管电泳分离图谱图 2糖尿病人 HbA 1C 毛细管电泳分离图谱2. 2试图将毛细管内径换为 50L m, 分离电压降为 8kv, 分离时间延长至 8min, 对图 2中的同一份糖尿病人血样品进行分离 , 结果见图 3。
图 3毛细管内径 50L m, 分离时间 8m in,糖尿病人 HbA 1C 毛细管电泳分离图谱2. 3在相同电泳条件下 , 对一份糖尿病人血样品进行重复性实验 , 4次电泳分离得出图 4, HbA 1C 峰的迁移时间和峰面积 RSD 分别为 1. 08%和 2. 71%。
739中国实验诊断学 2009年 6月第 13卷第 6期图 4糖尿病人 HbA 1C 毛细管电泳重复性图谱2. 4在受检人群中 , 健康体检正常人为 60例 , 其 HbA 1C /HbA0比例分布范围为 2. 12%-5. 09%, 平均数 ? 标准差为 4. 02%? 0. 68%; 临床确诊糖尿病人为 38例 , 其 HbA 1C /HbA 0比例分布范围为 6. 71%-12. 38%, 平均数 ? 标准差为 8. 96%?0. 73%, 均满足报道中的参考值范围。
3讨论HbA 1C 的检测在糖尿病的筛选普查中具有早期提示价值 , 可作为轻症、 Ò型、 /隐性 0糖尿病的早期诊断指标 , 在治疗糖尿病的血糖监控中可作为参考、治疗指标 [3], 对糖尿病慢性并发症 , 例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性神经病变及糖尿病性肾病等的发展及预后的监测有很大的帮助。