2012鱼类细胞工程基础
课程安排
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本实验课的目的
➢ 培养实验的思维，提高实验技能，锻 炼动手能力。
➢ 掌握无菌操作，养成规范的实验室工 作习惯。
➢ 为将来适应多种领域的工作打基础。
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鱼类细胞培养的基本条件
1. 温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利 用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分 化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要 是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。 适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带 鱼)、15℃(寒带鱼)、37 ℃(水生哺乳动 物)。
6. 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为5%。
7. 去离子水/三次蒸馏水
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鱼类细胞培养的基本条件
8. 无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所
需的细胞进行培养，但环
境中（如空气）有各种其
他微生物，必须对所需细
胞进行无杂菌的隔离培养。
无菌条件是细胞离体培养
最基本的条件。
超净工作台
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实验室仪器设备
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三、准备玻片和染色
1. 用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL 2. 滴在湿玻片上 3. 火焰上拖动，固定2-3次 4. 放在预热的切片烘干机上，15 min （蒸发液体） 5. 把装有1N HCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热， 6. 把玻片插入培育 10min 7. 倾去HCl溶液 8. 用双蒸水清洗玻片2次 9. 空气干燥
要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。
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修读要求
1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察
和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和研究
生协商，各组时间要相对集中和固定。
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实验一&二 思考题
1. 培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？ 2. 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，
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鱼类细胞培养的基本条件
4. 营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生
长所需要的各种物质。 常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 动物细胞离体培养常常需要血清。血清提
供生长必需因子，如激素、微量元素、 矿物质和脂肪。 小牛血清；胎牛血清。
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鱼类细胞培养的基本条件
5. 支持物 大多数动物细胞有贴壁生长的习 惯。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶 等作为支持物。
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操作步骤
一、准备细胞
1. 接种细胞：T 75cm2 瓶子 1个 2. 培养24 h 3. 换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素
（1μg/L） 4. 培养13-15h 5. 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀
细胞 6. 加2 mL PBS混匀细胞 7. 将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内
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鱼类细胞培养的基本条件
2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋 白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH 至7.4左右。
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鱼类细胞培养的基本条件
3. 渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需 用平衡盐溶液配制各种试剂。
常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution） D--Hanks
可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存 起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 • 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的 细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了 细胞保种的作用。 • 可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运 送某些细胞。
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冻存原理
• 细胞冻存时向培养基中加入保护剂 --- 终浓度5% - 15% 的二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点 降低，加之在缓慢冻结条件下， 细胞内水分透出， 减少了冰晶形成， 从而避免细胞损伤。
不能高压灭菌 ？ 3. 生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜
色？为什么？ 4. 为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？ 5. 为什么复苏细胞时，要迅速解冻？
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实验五 染色体制备
• 每一物种的细胞一般都具有一定数目、形 状和大小的染色体。
• 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在 中期，此时染色体形态最典型，然后通过 低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜 下呈现出其形态。
实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： • 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 • 干燥箱: 用于干燥 • 超净工作台: 用于无菌操作 • 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 • 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 • 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 • 液氮罐：用于细胞长期保存
16Biblioteka 考核方法实验报告（论文格式） 一. 目的与意义 二. 材料与方法 三. 实验结果 四. 讨论（问题\经验\体会）
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8. 慢慢加10mL双蒸水（4℃） 9. 室温孵育10min 10. 慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：
甲醇＝1：3） 11. 室温放置10min 12. 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min 13. 弃去上清，留约 2mL 14. 加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞 15. 1000rpm离心，5min 16. 弃去上清，留约 0.5mL
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10. 将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现 稀释的1：25）
11. 孵育 15 min 12. 用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液 13. 空气干燥 14. 显微镜下观察计数
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实验六 细胞冻存
• 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 • 利用冻存技术将细胞置于 -196℃液氮中低温保存，
• 采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。 标准冷冻速度开始为 -1 - -2℃/min， 当温度低于 - 25℃时可加速，到 - 80℃之后可直接投入液氮 内（-196℃）。
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操作步骤
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17. 加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加 4mL新鲜固定液，轻轻混匀
18. 孵育 5分钟 19. 1000 rpm离心，5分钟 20. 弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL 21. 加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀
二、清洁玻片
1. 6-8个干净的玻片，浸泡在95% 乙醇里 2. 烘干 3. 浸泡在冰水里至少30 min