一、前言生物安全实验室主要用于从事涉及病原微生物的实验检疫和检测，由于从事微生物的检疫和检测关系工作人员的身体安全、健康以及工作环境的卫生，所以要求从事检疫和检测的工作人员具备相应的专业知识，并执行完善、严格的实验操作规程。

本手册作为生物安全实验室工作手册使用，指导工作人员使用和管理生物安全实验室。

二、本实验室的危险性评估当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。

危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的、基因修饰的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。

危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行，本实验室的由主任负责完成。

2.1 样本的生物学危险评估根据规定，本实验室（BSL-2级）主要从事出入境动物的检验检疫；以及出入境水产品的检验，涉及的生物学危险因子及其评估见表1。

2.2 实验试剂的生物学危险性评估存在生物安全危害可能的实验试剂必须进行生物学危险评估，评估原则遵照2.1。

2.3 通风系统的危险性评估2.4 水电系统的危险性评估2.5 仪器设备的危险性评估三、操作管理规程3.1 生物安全柜操作规程【启动准备】1如紫外灯为关闭，请关闭紫外灯；2启动安全柜的鼓风机和照明灯，检查进风口和排风口并确认它们未被覆盖、处于正常状态；3在操作使用之前，鼓风机至少应运行15分钟。

【擦抹消毒】1 用70%酒精、2%碱性脱水戊二醛或消毒效果相近、无腐蚀性消毒剂对安全柜内的所有工作面进行擦抹消毒。

【材料和设备】1 把材料和设备放置于安全柜内的工作面；2 任何物品放置均不能超出进风格栅的前后风口；在安全柜内工作面应隔离污染物，减少来回操作的次数；4不能使用明火的本生灯（煤气炉）；5禁止使用任何闪点在25华度以下的易燃物质。

【空气净化】材料和设备放置于安全柜内后应允许运行2~3分钟。

【运行操作】1 运行操作时应选用适宜的服装、长袖袖套，编织袖口和橡胶手套；2 尽量减少安全柜内的来回操作次数，并采用适宜的消毒措施。

【终末净化与擦抹消毒】1 从安全柜内取出材料与仪器之前，系统至少应运行2~3分钟；2完成操作后应进行终末消毒，擦抹消毒方法同上。

3熏蒸消毒生物安全柜内的污染清除时，可将适量的多聚甲醛(空气中的终浓度达到0．8％)放在电热板或电热盘上(在生物安全柜外进行控制)。

然后在生物安全柜内放置第二个放有比多聚甲醛多10 ％的碳酸氢铵的加热板或盘。

第二个盘上覆盖一个能够从远处将其移走的盖子(如连接一个能够从生物安全柜外拉动的绳子)，从而尽量减少对甲醛气体的提前中和。

如果相对湿度低于70 ％，在使用强力胶带[如“管道密封胶带”(ducttape)]密封前部封闭板前，还要在安全柜内部放置一个开口的盛有热水的容器。

如果前部没有封闭板，则可以用重型塑料布(heavy gaugeplastic，heeting)粘贴覆盖在前部以保证气体不会泄漏进入房间【关闭】关闭鼓风机和照明灯。

3.2 BSL-2实验室操作规程【准备】样本准备应在样品室内完成。

【启动】1、启动排风风机；2、启动生物安全柜1、2；3、启动送风风机；4、启动空调机。

系统运行至少十分钟，检查压差，核心室压差正常范围应在≤-10Pa,缓冲室压差正常范围应在≤0Pa。

【人员进入】1、系统参数处于正常状态，人员方可进入；2、人员进入时应更换工作服，按缓冲间1 缓冲间2 核心实验室的顺序进入。

【物品进入】1、实验人员进入核心实验室后，物品方可进入；2、物品应从传递窗输送进入。

【实验进行】1、实验操作应于生物安全柜内完成；2、实验用废水应用专用的接水桶盛接；3、带上备用更换的清洁工作服，留置于淋浴间内。

【物品消毒】1、实验结束，实验物品应置于高压灭菌器内灭菌；2、高压灭菌应遵循高压灭菌器的操作规程。

【人员退出】1、实验操作完成，实验物品已完成高压灭菌，方可认为实验结束；2、实验结束后，人员应从进入路线退出，在缓冲室内洗手，更换工作服，并用密闭的塑料袋负压包装；3、进入淋浴室，冲淋全身，并换上清洁工作服。

【系统关闭】1、关闭空调机；2、关闭送风系统；3、在确认生物安全柜内紫外线灯完成消毒后，关闭生物安全柜；4、关闭排风机。

【系统消毒】1、紫外线消毒定时于每天上午7：00~7：30、下午5：30~6：00，如需加班未能在此时段完成，应事先调节。

2、排风系统采用臭氧消毒，与紫外线灯同时进行。

【应急】1、实验室内如遇样品溅入眼睛，请脚踏洗眼器开关冲洗眼睛；2、如遇紧急停电，应急照明即自动启动，人员从正常路线退出。

3、如遇意外事故，击碎报警盒，按下按钮报警。

【特别注意】1、人员进入实验室内，紫外线灯应关闭，以免灼伤皮肤与眼睛；2、洗眼器使用完毕后，洗眼水应视危险性大小决定是否置于高压灭菌器内灭菌。

3.3 实验操作规程3．3．1样品的接收与开启接收和打开样品的人员应当了解样品对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用常规预防措施的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。

样品要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。

3．3．2移液管和移液辅助器的使用1．应使用移液辅助器，严禁用口吸取。

2．所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。

3．不能向含有感染性物质的溶液中吹人气体。

4．感染性物质不能够用移液管反复吹吸混合。

5．不能将液体从移液管内用力吹出。

6．刻度对应(Mark—to—mark)移液管不需要吹出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。

7．污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。

移液管应当在消毒剂中浸泡18／，24小时后再进行处理。

8．盛放废弃移液管的容器应当放在生物安全柜内，而不能放在外面。

9．固定有皮下注射针头的注射器不能够用于移液。

应当用钝头导管替代针头。

可以用工具打开瓶塞后再用移液管取样，从而避免使用注射器和针头。

10．为了避免感染性物质从移液管中意外滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其高压灭菌或按感染性废物处理。

3．3．3避免感染性物质的扩散1．为了避免转移物质洒落，微生物接种环的直径应为2—3mm并完全封闭，手柄(shanks)的长度应小于6cm以减小振动。

或者采用一次性灭菌棉签。

2．使用封闭式微型电加热器消毒接种环能够避免在本生灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。

最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。

3．为了避免产生气泡和气溶胶的扩散，不要在玻片上进行触酶试验，而应当采用试管、毛细管或盖玻片法。

4．准备高压灭菌和／或处理的废弃样品和培养物应当放置在防漏的容器内，如实验室废物袋。

5．在每一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。

3．3．4生物安全柜的使用1．应参考国家标准和相关文献，介绍生物安全柜的使用方法和局限性。

并发给工作人员书面的操作步骤、安全或操作手册。

应明确注明当出现溢出、破损或不良操作时，安全柜就不再能保护操作者。

2．生物安全柜必须运行正常时才能使用。

3．生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。

4．安全柜内应尽量少放置器材或样品，不能阻碍后部的气流循环。

样品在放人安全柜内的工作区前需要清除表面污染。

5．安全柜内不能使用酒精灯，否则燃烧产生的热量会干扰气流并可能损坏过滤器。

允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环；6．所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过观察挡板看到。

7．尽量减少操作者身后的人员流动。

8．操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。

9．实验记录、移液管以及其他物品不能够阻碍前面的空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。

10．工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。

11．工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行5分钟。

3．3．5 避免感染性物质的注入1．通过认真练习和仔细操作，可以避免破碎玻璃器皿的意外刺伤。

尽可能用塑料制品代替玻璃制品。

2．皮下注射针头、玻璃吸管以及破碎的玻璃均可能将感染性物质注入体内。

3．以下两点可以减少针刺事故：(a)注射时特别小心(b)减少使用注射器和针头；许多操作可用带有钝头导管的注射器替代。

可用一些简单的装置来打开瓶塞，然后使用吸管取样。

4．不要重新给用过的针头戴护套，一次性注射器用完后，不必将针头从注射器上取下，应丢弃在防穿透的带盖容器中。

5．应当用塑料吸管代替玻璃吸管。

3．3．6血清的分离操作1．只有经过严格培训的人员才能进行这项工作。

2．操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。

3．规范的实验操作技术可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。

血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。

严禁用口吸液。

4．移液管使用后应完全浸入次氯酸盐或其他适当的消毒液中。

移液管应在消毒液中浸泡至少18小时，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。

5．带有血凝块等的废弃样品管，在加盖后应当放在适当的防漏容器内高压灭菌和／或焚烧。

6．为了清洗喷溅和溢出的血样，应当备有每天新鲜配制的次氯酸盐溶液。

3．3．7离心机的操作使用1．在使用实验室离心机时，仪器良好的机械性能是保障微生物安全的前提条件。

2．应按照操作手册来操作离心机。

3．离心机放置的高度应当使低于平均身高的工作人员也能够看到离心机腔体内部，以正确放置十字轴和离心管套。

4．离心管和盛放离心样品的容器应当由厚壁玻璃制成，或最好为塑料制品，并且在使用前应检查是否破损。

5．用于离心的试管和样品容器应当始终牢固盖紧(最好使用螺旋盖)。

6．离心管套的装载、平衡、密封和打开必须在生物安全柜内进行。

7．离心管套和十字轴应按重量配对，并在装载离心管后正确平衡。

8．操作指南中应给出液面距离心管边缘需要留出的空间大小。

9．空离心管套应当用蒸馏水或乙醇(异丙醇，70％)平衡。

盐溶液或次氯酸盐溶液对金属具有腐蚀作用，因此不能使用。

10．对于危险度3级和4级的微生物，必须使用可封口的离心离心管套(安全杯)。

11．当使用固定角离心转子时，必须小心不能将离心管装得过满，否则会导致漏液。

12．应当每天检查离心机内转子部位的腔壁是否被沾染或弄脏。

如污染明显，应重新评估离心操作规程。

13．应当每天检查离心转子和离心管套是否有腐蚀或细微裂痕。

14．每次使用后，要清除离心管套、转子和离心机腔的污染。

15．使用后离心管套应当倒置存放使平衡液流干。

16．当使用离心机时，可能喷射出可在空气中传播的感染性颗粒。

如果将离心机放置在传统的前开式的I级或Ⅱ级生物安全柜内，这些粒子由于运动过快而不能被安全柜内的气流截留。

而在Ⅲ级生物安全柜内封闭离心时，可以防止生成的气溶胶广泛扩散。

但是，良好的离心操作技术和牢固加盖的离心管可以提供足够的保护，以防止感染性气溶胶和可扩散粒子的产生。