包被物
针对IgM的第二抗体 待测物 其中含有IgM和IgG
IgG等无关物质 被洗脱 特异性抗原与IgM结合
酶标抗体
具 体 步 骤
包被
封闭
加待测物
加一抗，二抗 ，或抗原等
显色
包
被
用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶 联板（聚乙烯微量反应板），每孔100μ。
用保鲜膜包好 ，4℃过夜。
应
用
ELISA 法由于测定灵敏、特异、操作简便、 酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反 射性污染，且易与其他相关技术偶联，使 其成为目前应用最广泛而且发展最快的一 种免疫测定技术。市场上符合质量要求的 商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、 酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成 分）和自动或半自动检测仪不断研究发明 问世，极大地促进了ELISA测定技术的普及。
加蒸馏水至1000ml
PBST 洗 液
2000ml PBS PBS： NaCl 8g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.42g；KH2PO4 0.27g； + 1ml Tween-20
加1000ml蒸馏水定容，调PH至7.4
洗板机
封
闭
用封闭液封闭，每孔100μ。
室温下，在微量振荡器上，封闭2h。
显色液
A液：0.2mol ／L Na2HPO4
Na2HPO4· 12H2O 71.7g加水至1000ml
B液：0.1 mol ／L 柠檬酸 柠檬酸 19.2g 柠檬酸，加水至1000ml
结 果 判 定
酶标测定仪检测（429nm），
测定OD值：
待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P： N）大于1.5或2者为阳性 注意：要有阴性，阳性对照。
应相结合而建立的一种新技术。
该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗
体系统均可用以检测。
酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原 免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学 活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使 基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型 变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光 度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从 而证明发生了相应的免疫反应。 所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细 胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位， 或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。
1，双抗体夹心法： 此法常用于检测抗原
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B 分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结 合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物， 复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非 竞争性反应类型。
包被物
抗体A
待测抗原
酶标抗体
2，间接法测定抗体 此法常用于测定抗体
将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与 抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待 测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量 与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
包被物
限量的的抗体 酶标抗原 样品抗原
酶标多于样品
样品多于酶标 显色程度浅
显色程度深
显色程度与待测物含量成反比
4，捕获法（反向间接法） 主要用于测定血清中某种抗体亚成分
以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某 种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，而后者可 干扰IgM的测定。因此，先针对IgM的第二抗体 (如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以 “捕获”样品中所有IgM；洗涤除去IgG等无关 物质，然后加入特异性抗原与待测IgM结合；再 次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二 抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色后， 即可对待IgM进行定性和定量测定。
用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔 100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器 上孵育1小时。清洗。
注 意
抗体抗原反应比较快，一般1~2个小时就 达到峰值。延长反应时间容易出现非特异 结合，但反应时间不能少于1.5小时。 二抗的使用浓度（一般，1：10000稀释） 应当进行预实验确定，二抗的反应时间不 能过长，容易出现非特异反应。一般，反 应40~60分即可。
包被物
抗 原 待测抗体 酶标二抗
3，竞 争 法 此法既可用于检测抗原和半抗原， 也可以用于检测抗体
用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原 （抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体 （抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形 成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就 少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程 度与待测物含量成反比。
如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好 过夜。 次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。
用PBST洗液，洗4~5次。
每次在洗板机清洗酶联板上震荡2~3min后， 在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。
包被液
0.05M PH 9.6 磷酸盐缓冲液
Na2CO3 1.59 g ；
NaHCO3 2.93g ；
基 本 原 理
先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上， 并保持其免疫活性。
测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步 骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。
然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定 量。
方 法 类 型
酶联免疫吸附试验的主要技术类 型有双抗体夹心法、间接法、竞 争法、捕获法等。
OPD
显
色
临用前取A液5.14ml，B液 4.86ml加入 OPD (邻苯二胺，在-20℃中保存） 0.0040g（约4小片），溶解后加入50μl的 30%H2O2，配成显色液。（OPD要充分混 匀，否则容易出现个别孔颜色太深）
显色液每孔100μl。避光显色15~20min。 用2mol／L H2SO4终止反应，每孔50μl
ELISA
酶联免疫吸附试验
主讲人：刘 畅 研究生
导 师：马学恩 教 授
ELISA （酶联免疫吸附试验）
Enzymes linked immunosorbent assay
简
试验。
介
1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者 Van Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中 微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附 ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反
弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。 用PBST洗液，洗4~5次。（同包被）
用保鲜膜包好，4℃可保存一个月。
封闭液
10 % 小牛血清 （1ml小牛血清加到9ml 1×PBS中混匀）。 5品
待测样或标准一抗： 用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔 100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器 上孵育2小时。清洗。 二抗：
所有血清学试验要注意
为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂 中必须至少有一个试剂是可检测的纯品
必须有一种分离方法使得结合的标记物与没 有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异 性结合的百分比。
谢谢大家！