脓汁和粪便标本中病原菌的分离培养与检测专业：中西医临床医学七年制学号：2012054015 姓名：杨小静实验目的：本次脓汁粪便标本中病原微生物的检测实验，旨在通过培养基制备，病原菌的分离与培养，以及细菌鉴别实验如革兰氏染色法，血浆凝固酶试验，药敏试验，半固体接种法实验，从而对医学微生物学主要的研究方法和手段有一定程度的了解，初步掌握微生物试验的基本技能和原理，也有助于无菌观念的树立。

1.实验器材：接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、生物显微镜、电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子2.实验方法与步骤：①培养基的制备②细菌的分离培养③细菌的纯培养④细菌的形态学检查⑤细菌的生化试验等⑥细菌的血清学试验、结果第一次实验2.1培养基的制备、消毒和灭菌如下图表格内容要求所示制备培养基。

表一组号培养基称量(g) 水量(ml)煮沸(次)分装(ml)备注（40人份）1 营养琼脂11.4 300 4瓶，500ml瓶，平板2～4 营养琼脂 2.9 75 3 5 15支×3，中试管，斜面5～7 营养肉汤 1.1 50 1 3 15支×3，小试管，液体8～10 半固体 1.9 50 3 3 15支×3，小试管，高层第二次实验2.1手指和空气的细菌学检查实验步骤：1空气的细菌学检查：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中15分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。

37℃温箱培养24小时，观察结果。

（※CFU/m3 ＝50000N÷AT≈86N(直径7cm平板）。

N：平板上的菌落数。

A：平板面积(平方厘米)。

T：采样时间(分钟)。

CFU /m3 ＝50,000N÷AT ≈83332手指皮肤的细菌学检查：上:甲、丙→常规洗手甲和乙、丙和丁共用1个平板下:乙、丁→标准洗手第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照在培养基表面触摸2～3厘米手指皮肤细菌检查结果分析比较洗手前后细菌的种类。

洗前细菌种类多。

洗后细菌种类少。

洗手能洗掉大多数暂住菌。

比较常规和标准洗手的细菌数量。

常规（简单）洗手，平板上细菌数量少。

标准洗手，平板上细菌数量多。

原因：常住菌数量大，牢固附着在皮肤上，常洗不掉，可洗松动，经摩擦接种、脱落到培养基上，显示细菌更多碘酒和酒精棉球消毒以后没有细菌生长。

空白对照有没有细菌生长。

第三次实验2．2细菌的分离与培养2.2.1采用平板划线分离法，取脓汁标本在普通平板表面划线，取粪便标本在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。

小组实验分工甲→脓汁标本(pus specimen)→营养琼脂平板(nutrient agar plate)乙→脓汁标本(pus specimen) →营养琼脂平板(nutrient agar plate）丙→粪便标本(stool specimen)→伊红美蓝(eosin methylene blue plate）丁、戊→粪便标本(stool specimen) →伊红美蓝平板(EMB plate）2.2.2观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色。

第四次实验2.2.3细菌的纯培养：取脓汁标本在普通平板上的黄色、白色单菌落，粪便标本在伊红美蓝平板上的紫黑色、淡粉红色单菌落接种在四个斜面培养基，标记，在37℃培养18h。

注意事项：从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。

2.3细菌个体形态特征的观察2.3.1革兰染色法观察细菌形态。

涂片的制备甲→金黄，紫黑。

乙→白色，粉红。

丙→金黄，紫黑。

丁→白色，粉红。

甲：金黄色乙:白色丙：紫黑丁：粉红色、①手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。

②促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。

染色：结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗稀释→复红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检。

革兰阳性菌革兰阴性菌图片分析：1用普通平板，从浓汁标本中分离得到金黄、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。

结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。

2用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。

紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。

粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。

显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。

第五次实验2.4细菌生化反应鉴定2.4.1糖发酵试验用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。

甲→紫黑→①葡萄糖乙→紫黑→②乳糖丙→粉红→③葡萄糖丁→粉红→④乳糖糖发酵试验结果2.4.2细菌药物敏感性试验甲→金黄菌液乙→白色菌液丙→紫黑菌液丁→粉红菌液接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液3～6ul×2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。

设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。

作标记：青、链、庆。

镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。

37℃18～24小时培养，观察结果。

乙白色菌液、甲金黄菌液丙紫黑菌液丁粉红菌液药敏试验结果分析（录入）青霉素先锋霉素Ⅴ庆大霉素金黄细菌—＋＋白色细菌—＋＋紫黑细菌—＋＋粉红细菌—＋＋注：耐药－，中度敏感±，敏感＋。

2.4.3血浆凝固酶试验取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，涂匀呈云雾状，立即观察结果。

白色菌液金黄菌液2.4.4半固体接种法接种针斜面取四种不同颜色的细菌，各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。

在37℃下,培养24小时，观察结果。

2.4.5 痢疾血清玻片凝集反应取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。

用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。

3.实验结果与讨论3.1脓汁和粪便病原微生物检测结果。

3.1.1细菌的分离与培养的结果。

脓汁中的细菌在普通平板上形成黄色和白色菌落。

粪便中的细菌在伊红美蓝固体培养基上形成紫黑色和粉红色菌落。

伊红美蓝为指示剂，具有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。

大肠杆菌分解乳糖产酸，使伊红美蓝呈色，形成紫黑色菌落，且有金属光泽；肠道致病菌不发酵乳糖，菌落成粉红色，有时可因碱性物质较多，细菌带负电荷染上美蓝而成蓝色菌落。

3.1.2观察细菌形态的实验结果。

脓汁的黄色和白色菌落中的细菌革兰染色紫色，阳性，萄萄串珠样排列球菌，疑似葡萄球菌。

紫黑色和粉红色的细菌呈杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。

用革兰染色法观察细菌的形态时脱色时间不要太久免得影响实验结果，油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。

使用后记得擦洗干净。

3.1.3糖发酵试验结果。

不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。

紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中皆变色和产生气泡，说明紫黑色细菌均能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。

粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，说明其能分解葡萄糖，产酸不产气；在乳糖发酵罐中既不变色又不产生气泡，说明其不能分解乳糖，不产酸不产气。

在进行糖发酵试验时，试验完成后，管口不能朝上，这是因为管口朝上时，反应过程中产生的气体会溢出，观察不到正确的实验结果，最终会影响到细菌的最终鉴定。

3.1.4药敏实验结果。

表二常用药敏试验纸片判断标准抗菌药物纸片含药量耐药抑菌圈直径(mm)耐药中度敏感敏感青霉素G(葡萄10单位≤28 - ≥29球菌)链霉素10微克≤11 12～14 ≥15庆大霉素10微克≤12 13～14 ≥15四环素30微克≤14 15～18 ≥19氯霉素30微克≤12 13～17 ≥18磺胺300微克≤12 13～16 ≥17表四药敏实验结果分析青霉素链霉素庆大霉素黄色细菌+ + +白色细菌+ + +紫黑细菌- + +粉红细菌- + +注：耐药－，中度敏感±，敏感＋G+金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素敏感，对链霉素中度敏感。

感染后用青霉素治疗效果较好。

G-粉红色和紫黑色细菌对青霉素耐药，对链霉素敏感。

感染后用链霉素治疗效果较好。

G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。

3.1.5血浆凝固酶试验的结果分析。

观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落细菌不出现凝集反应，说明其为凝固酶阴性，不是致病菌3.1.6紫黑色和粉红色细菌在半固体培养基中的结果。

紫黑色细菌在半固体培养基内呈扩散生长,培基混浊，说明该细菌有鞭毛；粉红色细菌在半固体培养基内沿接种线生长,培基清澈透明，说明该细菌无鞭毛。

表五紫黑色和粉红色细菌生化反应结果分析紫黑菌落粉红色菌落葡萄糖乳糖半固体葡萄糖乳糖半固体⊕⊕+ + - -3.1.7痢疾血清玻片凝集反应的结果分析。

紫黑色菌落的细菌不能使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其不是引起痢疾的致病菌；粉红色菌落的细菌使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其是引起痢疾的致病菌。

在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌)与特异性抗体混合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。

凝集反应的机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基。

极性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由亲水溶胶变成憎水溶胶。

电解质具有降低电位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生了凝集现象。

附肠道各菌属生化反应鉴别表。

表六葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖半固体+产酸或阳性， ⊕产酸产气，-阴性， +/-多数阳性， -/+多数阴性， √不确定。

由上述实验结果可得脓汁和粪便标本细菌检测结果如下表所示 表七 （+ 产酸或阳性， ⊕ 产酸产气，- 阴性， +/- 多数阳性， -/+ 多数阴性， √不确定）埃希菌属 ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ √ -志贺菌属 + √ √ +/- -/+ -沙门菌属⊕/+ - ⊕ ⊕ - -霍乱弧菌 + - + + + +变杆菌属⊕- √ - √ +标本 菌落形态血浆 凝固酶葡萄糖乳糖 半固体培养基 痢疾血清青霉素链霉素庆大霉素结论脓汁 黄色 G +球菌 ++ + + 金黄色葡萄球菌白色 G +球菌 - + + + 白色葡萄球菌 粪便 紫黑G -杆菌 ⊕ ⊕ + - + + 大肠埃希菌 粉红G -杆菌 + - - + - + + 福氏志贺菌。