实验六淀粉酶动力学分析（Ⅰ）——DNS法葡萄糖标准曲线的制作及不同pH和温度条件下的淀粉酶活力测定（4学时）第一部分3, 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量一、实验目的学习3, 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的原理。

掌握3, 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理在NaOH和丙三醇存在下，3, 5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540 nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

三、实验器材与试剂实验器材1. 722分光光度计2. 电子天平3. 恒温水浴锅4. 1.5KW电炉5. 18×180 mm试管6. 40孔试管架7. 100 mL容量瓶8. 500 mL棕色试剂瓶；棕色及无色250 mL试剂瓶；无色200 mL试剂瓶；50 mL棕色试剂瓶9. 100 mL量筒10. 200 mL烧杯、500 mL烧杯11. 1 mL吸量管、2 mL吸量管、5 mL吸量管、10 mL吸量管12. 纱手套13. 玻璃棒14. 滤纸15. 称量纸16. 橡皮筋17. 化学试剂：3, 5-二硝基水杨酸、NaOH、丙三醇、葡萄糖均为分析纯实验试剂1. 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量蒸馏水中，移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L NaOH溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL（老师准备）。

2. 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200 mg，加入少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100 mL，即含葡萄糖为2.0 mg/ mL（学生配制）。

3. 样品糖溶液：0.2-1.8 mg/ mL(老师准备)。

4. 250 mL蒸馏水装于250 mL无色试剂瓶中（学生准备）。

四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线的制作取11支18×180 mm试管，按下表分别加入2.0mg/ mL葡萄糖标准溶液和蒸馏水，实验组做两组平行实验。

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0 mL，试管用橡皮筋扎好，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值。

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线（采用excel 中的散点图法作图，注意坐标单位和作图格式）。

2. 样品中还原糖测定取3支18×180 mm 试管，分别按下表加入试剂。

在加入上述试剂后，于沸水浴中加热2 min 进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL 烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL ，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm 波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量。

管号项目12345葡萄糖标准溶液（mL ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL ） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 葡萄糖含量（mg /mL ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 DNS 溶液（mL ）2.02.02.02.02.02.0沸水浴2 min 后冷却蒸馏水（mL ） 9 9 9 9 9 9 OD 值管号项目 对照 样品0 1 2 蒸馏水（mL ） 1.0 0 0 样品溶液（mL ） 0 1.0 1.0 DNS 溶液（mL ）2.02.02.0沸水浴2 min 后冷却蒸馏水（mL ） 9 9 9 OD 值葡萄糖含量（mg /mL ）3. 样品还原糖含量的计算还原糖含量（mg/ mL）=CXC——从葡萄糖标准曲线中读得的葡萄糖含量，mg/ mL；X——样品的稀释倍数，此处为1。

第二部分PH对酶活性的影响一、实验目的了解pH对酶活性的影响学习测定酶最适pH的方法二、实验原理酶的活性受环境pH的影响极为显著。

通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。

一种酶表现其活性最高时的pH值，成为该酶的最适pH。

低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。

不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。

应当指出，酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。

例如，α-淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。

淀粉酶活力以淀粉酶酶解淀粉形成还原糖的能力表示。

三、实验器材与试剂实验器材1-16. 见本实验第一部分17. 化学试剂：可溶性淀粉、柠檬酸、磷酸氢二钠均为分析纯，α-淀粉酶实验试剂1. 0.2M磷酸氢二钠溶液（共6000 mL）2. 0.1M柠檬酸溶液（共6000 mL）3. 不同pH磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制：按下表分别配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液各800 mL，用于1%淀粉溶液的配制。

组成0.2 M磷酸氢二钠（mL）0.1 M柠檬酸（mL）缓冲液pH3.04.11 15.894.0 7.71 12.295.0 10.30 9.706.0 12.637.377.0 16.47 3.538.0 19.45 0.554. 1%淀粉溶液：称取1 g可溶性淀粉于200 mL烧杯中，用5 mL pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调成糊状。

另取200 mL烧杯，盛入95 mL 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于电炉上烧开，倒入60 mL缓冲液于盛有淀粉糊的烧杯中，搅拌均匀，继续煮开并搅拌至透明状，冷却后转至100 mL容量瓶中，用剩余缓冲液荡洗烧杯，合并于容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度（老师准备）。

5. α－淀粉酶：活性为2000 u/mL(常用单位为u：1酶活力单位为50℃，pH5.0条件下，1分钟液化可溶性淀粉1 mg成为糊精所需要的酶量；而国际单位为IU：分解或生成1 umol底物或产物所需要的酶量)的中温α－淀粉酶，用蒸馏水（应用不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释，但考虑到同学们分别配制不方便，故用蒸馏水稀释，这对酶反应体系pH有一定影响，但由于淀粉溶液为缓冲液配制，且量为酶液的三倍，故对反应体系pH影响不是很大）稀释1000倍（老师准备）。

5. DNS试剂：见本实验第一部分（老师准备)四、实验方法取13支干燥的18×180 mm 试管，按下表编号，实验组做两组平行试验，加入不同pH 的淀粉溶液和α-淀粉酶溶液（mL ），50℃反应10分钟，反应液稀释一定倍数（约10倍，取1 mL 反应液，加9 mL 蒸馏水，混匀），取1 mL ，加DNS 试剂，于沸水浴中加热2 min 进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL 烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL ，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm 波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶活力。

管号项目 0123456pH5.0 3.0 4.0 5.06.07.08.0 1%淀粉溶液（mL ）33 3 3 3 3 3 α-淀粉酶溶液（mL ） 1（煮沸灭活）11111150℃反应10分钟，稀释一定倍数（约10倍），取1 mL 用于DNS 反应。

DNS 溶液（mL ）2.02.02.02.02.02.02.0沸水浴2 min 后冷却蒸馏水（mL ） 9 9 9 9 9 9 9 OD 值葡萄糖含量（mg/mL ）酶活力（IU/ mL ）α-淀粉酶酶活力计算公式为（IU/mL ）：124100018010C X X ⨯⨯⨯⨯⨯C ——从葡萄糖标准曲线中读得的葡萄糖含量，mg/ mL4——酶解液共为4 mL ，测定的还原糖为1 mL 酶解液中的还原糖量，所以应×4X1——酶解液的稀释倍数X2——酶的稀释倍数1000——由mg单位转为μg单位时所乘的倍数180——葡萄糖的分子量10——反应时间为10分钟绘制α-淀粉酶在不同的pH条件下的酶活力曲线（采用excel中的散点图法作图）。

第三部分温度对酶活性的影响一、实验目的了解温度对酶活性的影响学习测定酶最适温度的方法二、实验原理酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。

通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。

另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。

因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。

反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。

高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。

大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。

但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。

通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。

为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。

酶对温度的稳定性与其存在的形式有关。

实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。

溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，而且容易为微生物污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。

三、实验器材与试剂实验器材1-16. 见本实验第一部分17. 化学试剂：可溶性淀粉、柠檬酸、磷酸氢二钠均为分析纯，α-淀粉酶实验试剂1. 1%淀粉溶液：称取1 g可溶性淀粉的200 mL烧杯中，用5 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调成糊状。

另取200 mL烧杯，盛入95 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于电炉上烧开，倒入60 mL于盛有淀粉糊的烧杯中，搅拌均匀，继续煮开并搅拌至透明状，冷却后移至100 mL容量瓶中，用剩余缓冲液荡洗烧杯，倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度（老师准备）。

2. α-淀粉酶：活性为2000 u/mL的中温α－淀粉酶，用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释1000倍（老师准备，现用现配）。

3. DNS试剂见本实验第一部分（老师准备)四、实验方法取13支干燥的18×180 mm试管，按下表编号，实验组做两组平行试验，按下表加入pH5.0的淀粉溶液和α-淀粉酶溶液（mL），不同温度下反应10分钟（全实验室需确保有6台水浴锅，按照组号顺序分别将水浴锅温度控制在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，并依次循环），反应液稀释一定倍数（约10倍，取1 mL反应液，加9 mL蒸馏水，混匀）取1 mL，加DNS试剂，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶活力。