实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
非特异性产物
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化:
1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不 易检测
2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
• • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
4. 反应Buffer 体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 法
起始模板的测定
基因型的分析
应用范围
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测 摘要目的: 探讨肝组织中HBV DNA 和病毒转录体与终 末期肝病的关系. 方法: 用TRIzol 从肝组织中提取组织核酸, PCR 及RT������ PCR 扩增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和 trRNA, 琼脂糖凝胶电泳显示产物, Southern������ blot 杂交验 证PCR 扩增的可靠性. 结果: 27 例HBsAg ( + ) 肝组织, 19 例 HBx DNA/ RNA 检测均为阳性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 检 出率较HBeAg( - ) 者高; 22 例HBsAg ( - ) 肝组织, 有16 例可 检测到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隐匿性感染在中国人 终末期肝病中有较高的检出率72. 7%; HBV 病毒转录体 trRNA 在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏 疾病( P < 0. 05) . 结论: HBV隐匿性感染与中国人终末期肝 病的发生密切相关, 肝组织中HBV trRNA 也与终末期肝病关 系密切.
实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR)
实时荧光定量PCR定义
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 高通量基因检测方法的验证 药物疗效考核 耐药性研究
SYBR Green
SYBR Green 法

工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光
复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。
实时荧光定量PCR原理
Excitation
SYBR Green I 工作原理
3’
No Emission
5’
SG SG SG
SG
5’
3’
Excitation
SG 5’ 3’
SG
SG
SG
SG
SG
SG
3’ 5’
Emission
SYBR Green 法
融解曲线分析
融解曲线分析，单一峰
无非特异性荧光 定量准确
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应： • X=X0*2n •非理想的PCR反应： • X=X0 (1+Ex)n
实时荧光定量PCR法
绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA
标准样品
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
相对定量中的内标 • 内标通常是β-actin、GAPDH、18S rRNA基因等看家基因 • 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小
•内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量