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三、原癌基因的激活机制 原癌基因具有正常的生理功能，被激活时又具有
致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。 现已证实 射线辐射 化学致癌剂 病毒感染
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(一)原癌基因点突变(point mutation) 癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸
发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化， 从而获得了转化细胞的活性
可受多种激酶系统催化而发生磷酸化
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（2）作用： 不同程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完
全消失。非磷酸化的Rb可防止细胞增殖，当DNA肿 瘤病毒抗原结合了非磷酸化的Rb时，Rb的活性就受 到抑制，使细胞转化为无限增殖状态，形成肿瘤
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对于大量来自视网膜母细胞瘤的Rb基因序列进行分析， 发现Rb基因完全或部分发生缺失；另一些Rb肿瘤中， 基因完整，但序列分析显示有一个突变，它常发生于 剪接点上，由于这一变异导致Rb mRNA组装时有外显子 被漏掉，因而产生异常Rb蛋白质
– 1981年 Bast
CA125（OC125）
• 第3阶段（1990以后）：基因标志
– 肿瘤基因标志
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一、原癌基因(oncogene，onc)及其表达产物的作用
1、定义： 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）
固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生 物特征的基因总称。原癌基因包括病毒癌基因（v-onc） 和细胞癌基因（c-onc）两种，它们在正常情况下以非激 活的形式存在，故称原癌基因。负责调控正常细胞的生 命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期 进展、细胞存活以及DNA转录等。一旦这类基因发生某些 错误或功能丧失时，极易导致原癌基因转变为可使正常 细胞转化为肿瘤的转化基因或癌基因。
由于野生序列与突变序列的PCR产物片段的Tm不同，它们在电泳过程中被部分解 链的先后不同，经过一定时间的电泳，可以发现这些产物片段在凝胶中所处 的位置也不同，据此，可以区别野生序列片段还是突变序列片段。
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5、Southern Blot
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互 补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分 离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位 将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放 射自显影或酶反应显色。
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2、限制性片段长度多态性(RFLP)分析
聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR— RFLP）分析技术是在PCR 技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别 位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异 扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电 泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR— RFLP，可检 测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标
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4、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)
在设计引物时应使被扩增的靶基因片段的两端含有不同的Tm值，一端较高，另 一端相对较低。将PCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行 分离，当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中Tm值较低一端的双链 被部分变性而解链，这种部分解链的构象致使该片段的电泳迁移率大大降低。
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细胞癌基因的作用： 通过其表达产物蛋白质来体现的，负责调控正常细胞的生 命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进 展、细胞存活以及DNA转录等。
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二、癌基因
定义：原癌基因在进化上高度保守，负责调控正常细胞的生命 活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细 胞存活以及DNA转录等。一旦这类基因发生某些错误或功能丧失 时，极易导致原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤的转 化基因或癌基因
记进行连锁分析进行间接基因诊断。
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3、PCR-SSCP、测序等
➢ 单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成 ➢ 突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链 ➢ 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁
移率，从而能区别正常与突变的DNA
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2、特点： （1）v-onc是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能
引起细胞转化 （2）c-onc是存在于正常细胞基因组中的癌基因，
在正常情况下处于静止或低表达的状态，不 仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具 有重要作用，但在异常表达时，其产物可使 细胞无限制分裂
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细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性即它 们的DNA序列是相对应的，表达产物也基本相同
基因易位（translocation） 基因重排（rearrangemant）：
有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染 色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相 对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著 增加而导致肿瘤的发生
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染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对 染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高， 蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活 性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生
肿瘤的分子生物学检验
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2015.11.30
肿瘤标志物的研究历史
• 第1阶段（1963-1978）：癌胚性抗原
– 1963年 Abelev
AFP
– 1965年 Gold & Freeman
CEA
• 第2阶段（1979-1989）：糖链抗原为主
– 1980年 Koprowski
CA19-9（1116-NS-19-9）
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(三)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)对阻抑基因的
转录具有重要作用
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现已发现在结肠腺癌和小细胞肺癌的细胞中，ras基因
的DNA甲基化水平比其邻近的正常细胞明显偏低，提示 某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活
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(四)原癌基因的拷贝数增加
后凋亡（apoptosis）—抑癌基因
两种信号保持着动态平衡，对正常细胞的生长、 增殖、死亡精确地调控，当平衡被破坏，正调控信 号基因功能过盛或负调控信号基因失活，导致细胞 增殖调控的混乱而使细胞恶变
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原癌基因的激活 1、ras基因的变异 2．myc基因的变异
抑癌基因的失活 1、Rb基因的失活 2、p53基因的失活 3、其他：
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四、抑癌基因
抑癌基因(suppresser gene)又称抗癌基因(anti-
onc)，是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因， 并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时， 可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生
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（一）抑癌基因及其表达产物 抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能
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基因2
基因1
原癌基因
M
W
肿瘤
抑癌基因
M
W
抑癌基因又称M为隐性癌M 基因肿瘤
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（2）p53基因 ★特点：17p13，11个外显子，10个内含子 ★编码：393个氨基酸，p53
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★作用：产物能结合DNA和被磷酸化。 （1）抑制肿瘤细胞停滞在修复前期不能进入S期复制DNA 而促使细胞凋亡
mutation
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(二)原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的
mRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可
激活原癌基因，使其表达产物增多 病毒的增强子常位于5’端的长末端重复序列
(1ong terminal repeat，LTR)内。如果增强子插入到 原癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的 表达比正常表达增高几十甚至上百倍
与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑 癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反
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（二）抑癌基因失活机理 1、视网膜母细胞瘤(retino-blastoma，Rb) （1）特点： ★基因组成：27个外显子，3-17外显子区域是基
因重组和突变的热点 ★编码：p105的蛋白质，其有结合DNA的活性，
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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6、基因芯片
集成化的核酸分子杂交技术
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谢谢
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基因扩增(amplification)： 某些癌基因通过一些机制在原来的染色体上复制
多个拷贝，超出了正常细胞的癌基因剂量，导致基因 产物的增加，从而使细胞正常功能紊乱
例如： 人视网膜母细胞瘤：N-myc扩增了10-200倍，相应
的mRNA和蛋白质产物也都大量增加
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(五)基因易位或重排使原癌基因激活
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野生型p53的蛋白质
p53下调bcl-2而 上调bax，促进细胞 凋亡过程。向丢失 p53等位基因的肿瘤 细胞中导入野生型 p53就会使肿瘤细胞 凋亡
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正常细胞的生长增殖由两大基因调控 正调控信号：促进细胞生长和增殖，并且阻止
其发生终末分化—癌基因 负调控信号：促进细胞成熟，向终末分化，最
BRCA1和BRCA2：与遗传性高发乳腺癌相关的基因， 与卵巢癌的发生也紧密相关