提高外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达策略本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。

大肠杆菌具有操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养的特点，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。

尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。

这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。

影响大肠杆菌中蛋白表达量的因素有载体启动子结构、质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素。

在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行总结，以期有助于研究。

1.有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。

其主要构件包括启动子、终止子、抗终止子、弱化子、绝缘子和增强子等。

1．1启动子理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[1]。

在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在 -35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[2]。

Shine-Dalgarno(SD)位点在翻译起始阶段与16S rRNA的3’端相互作用[3]。

SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[4]。

在RBS的5’和3’端均为A丰富区。

转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期。

但目前发现在转录过程中部分启动子在转录为RNA后可引起导致转录后基因沉默，从而减少目的蛋白量（a）。

某些启动子还识别特异性的RNA聚合酶（ rnap ），特异性的RNA聚合酶（ rnap ）可以分辨出不同的启动子结构，优先启动推动者与目的序列。

（c）还有研究表明有关基因表达的假设增强子与启动子之间相互作用发生分子间的结构独立功能联合的复合体增强启动子功能，该结构具有特异性。

并不是所有增强子与启动子都能发生功能联合的复合体（b）。

目前在E.coli中发挥作用的启动子很多。

通常常被使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L(l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。

1．2 终止子在一个基因的3末端或是一个操纵子的3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。

在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。

一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离，它是一种环状hexameric蛋白质和ATP解旋酶的活动。

nusg ，nusa和nusb是以附加因素的形式参与终止进程。

rho依赖性终止作用是当rho与游离核糖体中富含C 的位点相结合后产生的， rho的ATP酶激活rho - mRNA的终止子作用，并为其提供能量，使rho能够在mRNA上向前移行;移行过程中是mRNA上的讯息进入六聚体的中心孔，当移行到转录底物释放rho的解旋酶时聚合酶停止工作转录终止（d，e）。

另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区[5]。

贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵[6]。

这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。

同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录[7]。

同时对于大肠杆菌来说，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，对于UAAN 和UAGN系列终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小依序为U＞G＞A、C。

UAG 极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为U＞G＞A＞C。

1．3抗终止子细菌中许多参与氨基酸生物合成的操纵子在其第一个结构基因的5’端含有转录衰减子。

衰减子由特定操纵子的氨基酸产物调节。

这样关联的带电荷tRNA的存在就会在核糖体剪切之后引导初始转录本中二级结构的形成。

如果没有关联的带电荷tRNA，则会形成抗终止子结构，从而抑制终止子中发卡结构的形成和转录的终止[8]。

其中hutp是一种RNA结合蛋白表达的调节有关氨基酸利用率的操纵子，具有约束力的顺式调控序列。

（g）它要求组氨酸和镁离子结合才能进行mRNA的表达。

在研究中，已证明了几个二价阳离子可调解hutp RNA的相互作用。

最好的二价阳离子被锰，锌和镉，其次是镁，钴和镍离子，而铜离子， yb2 +和Hg2 +无效。

在hutp RNA的互动中表明金属离子能调解蛋白质核酸相互作用，增强mRNA的转录(f)。

在rho依赖性终止中抗终止元件能使RNA 多聚酶越过核糖体RNA操纵子中的rho依赖性终止子即boxA[9],从而达到抗终止子的作用。

1．4弱化子弱化子(attenuator)是在研究大肠杆菌的色氨酸操纵子表达弱化现象中发现的。

在trp mRNA 5’端trp正基因的起始密码前有一个长162 bp的DNA序列称为前导区，其中第123～150位核苷酸能影响色氨酸的表达，如果缺失，trp基因的表达水平可提高6倍。

这个区域被称为弱化子。

弱化作用在原核生物中是相当普遍的，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中已陆续发现不少操纵子都有弱化现象。

例如在AmpC酶的表达过程中，其基因上的弱化子为一段不稳定的发卡结构（h）,但这段发卡结构较易突变，若其上16~43基因缺失将改变这一结构使其弱化作用消失（i）。

1．5绝缘子绝缘子(insultor)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。

绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用，其作用机制可能是取消核酸的碱基的配对作用，和阻断增强子机制(j).1．6增强子增强子（enhancer）指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。

增强子是通过启动子来增加转录的。

增强子的特点是：①在转录起始点5’或3’侧均能起作用；②相对于启动子的任一指向均能起作用；③大部分增强子发挥作用与受控基因的远近距离相对无关，但也有小部分增强子其作用与受控基因的远近有关（K）；④对异源性启动子也能发挥作用；⑤通常具有一些短的重复顺序。

如今已经在细菌和噬菌体中鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列。

Olins等从T7噬菌体基因10前导序列（ g10-L）中鉴定了一9bp的序列，该序列似乎能替代有效的RBS。

同SD共有序列相比，g10-L能使多种基因的表达水平提高40-340倍[10]。

另外的研究小组在mRNA的5’非翻译区（UTR）鉴定了一U富含序列，该序列同样具有翻译增强子活性。

McCarthy等[11]在 E.coli atpE基因中紧接于SD位点下游鉴定一类似区域。

同时增强子的作用强弱与细胞培养的理化条件有一定的关系，例如，当在缺氧的条件下(EPO)3‘增强子野生片段或其突变片段其作用将不是增强目的基因的表达，而是相反起到抑制作用（L）。

而且部分增强子的作用强弱与其所转入细胞也有关系。

（m）2.培养条件E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。

高细胞密度培养系统可以分成三类：分批培养、补料分批培养和连续培养。

这些方法能获得超过100g/升的细胞浓度，从而获得廉价的重组蛋白。

培养基的组成需要仔细地计算和监控，因为这对细胞和蛋白质的产生具有重要的代谢效应。

营养成分和培养参数如pH、温度和其他参数都会影响蛋白酶的活性、分泌和产量[12]。

已经证明对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。

例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解[13]。

同样，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜碱存在的渗透压力下培养细菌，可以使可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍[14]。

同时，在表达外源蛋白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生．外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖．以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一。

外源蛋白的构象也是影响可溶性表达量的重要条件，可通过影响外源蛋白的化学键的形成来影响结构的改变。

例如，外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量．某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性[15]．另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有助于获得高产量的活性蛋白。

同时，高细胞密度培养系统也有其自身的缺陷。

这些缺陷包括在高细胞密度情况下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能够降低生长速度、刺激乙酸形成降低发酵罐的混合效率和产热等。

利用高细胞密度培养系统生产重组蛋白质的一个主要问题是乙酸的积累，近来这一问题通过将来自B. subtilis编码醋酸盐合成酶的alsS基因导入E.coli细胞中得以解决[16]。

3.诱导条件目前对于蛋白质在大肠杆菌中表达的诱导剂主要有β–半乳糖苷酶（IPTG）、乳糖和胞外超氧化物歧化酶等。

在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制．普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白．然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达．目前一般认为在菌体浓度在OD600在0.4~0.6之间效果较好，但Margret B等认为在OD600为0.5~2.0同样可获得较好的效果[17]。

．诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择[18]。