《医学分子生物学》作业(供“专升本”中西医临床医学专业学生使用成人教育学院《医学分子生物学》思考题1、述 DNA的右手双螺旋模型结构要点。

(1两股反向平行的 DNA 链绕成同轴右手双螺旋,双螺旋表面有大沟和小沟。

(2脱氧核糖和磷酸通过3’,5’-磷酸二酯键相连,构成 DNA 主链,位于双螺旋的外表面,糖基平面与螺旋轴平行;碱基则位于双螺旋的内部,碱基平面与螺旋轴垂直。

(3两股 DNA 链通过 Watson-Crick 碱基对结合,即 A 与 T 通过两个氢键结合,G 与 C 通过三个氢键结合,称为碱基互补原则。

这样,一股 DNA 的碱基序列决定了另一股DNA 的碱基序列,两股 DNA 链互相称为互补链。

(4双螺旋直径为 2cm2、真核生物基因组结构与功能的特点。

1.真核生物基因组 DNA 是线性分子,其末端序列特殊,由寡核苷酸短串联重复序列构成,称为端粒。

2.真核生物基因组 DNA 有多个复制起点。

3.真核生物有完整的细胞核,核 DNA 与组蛋白、非组蛋白及 RNA 形成染色体结构。

4.每一种真核生物的染色体数目都是一定的,除了配子(精子和卵子是单倍体以外,体细胞一般是二倍体。

5.真核生物基因组序列中仅有不到 10%是编码序列。

编码序列在基因组序列中的比例是真核生物、原核生物和病毒基因组的重要区别,而且在一定程度上是生物进化的标尺。

6.真核生物基因组含大量重复序列,包括高度重复序列和中度重复序列。

7.真核生物基冈是断裂基因,即基因是不连续的,由外显子和内含子交替构成。

8.真核生物基因的转录产物是单顺反子 mRNA。

9.真核生物基因组中存在各种基因家族,基因家族成员可以串联在一起,也可以相距很远,但即使串联在一起的基因也是分别表达的。

3、论述参与 DNA 复制的酶和蛋白质及其作用。

原核生物 DNA 的复制过程需要 30 多种酶和蛋白质参加。

主要有 DNA 聚合酶、解旋酶、拓扑异构酶、引物酶和 DNA 连接酶等:(1DNA 聚合酶 DNA 聚酶的作用是催化 dNTP 按5'→3'方向合成 DNA。

反应只消耗 dNTP,但还有两种成分必不可少:①模板:DNA 聚合酶催化的反应是 DNA 的复制,即合成单链 DNA 的互补链,所以必须为其提供单链 DNA,这就是模板;②引物:有了底物和模板,DNA聚合酶还是不能合成 DNA,因为它不能从无到有合成 DNA 链,只能把脱氧核苷酸连接在已有核酸的 3'-羟基上,而且该核酸的序列必须与 DNA 模板的3'端序列互补,并形成结合,这已有的核酸就是引物。

(2解链、解旋酶类 DNA 具有超螺旋、双螺旋等结构,在复制时,作为模板的亲代 DNA 分子需松弛螺旋,解开双链,暴露碱基,才能按碱基互补原则合成子代 DNA。

参与亲代 DNA 双链解链、并将基维持在解链状态的酶和蛋白质主要有解旋酶、拓扑异构酶和单链 DNA 结合蛋白。

(3引物酶 DNA 复制需要 RNA 引物,RNA 引物由引物酶催化合成。

(4连接酶环状DNA 或冈崎片段合成之后都留下切口,需要一种酶,能催化切口处的 5'-磷酸基与 3'-羟基连接形成磷酸二酯键,这种酶就是 DNA 连接酶。

4、转录与复制的不同点。

①目的不同,所使用的酶、原料及其它辅助因子不同,转录是合成 RNA,复制是合成 DNA;②方式不同:转录是不对称的,只在双链 DNA 的一条链上进行,只以 DNA 的一条链为模板,复制为半不连续的,分别以 DNA 的两条链为模板,在 DNA 的两条链上进行;③复制需要引物,转录不需要引物;④复制过程存在校正机制,转录过程则没有;⑤转录产物需要加工,复制产物不需要加工;⑥复制与转录都经历起始、延长、终止阶段,都以 DNA 为模板,新链按碱基互补原则,5'→3’方向合成5、大肠杆菌乳糖操纵子转录起始的复合调控。

是通过乳糖操纵子的阻抑调控和乳糖操纵子的激活调控进行复合调控的。

在没有乳糖存在时,阻抑蛋白与操纵基因结合,阻挡 RNA 聚合酶沿 DNA 移动,阻抑转录。

当有乳糖存在时,乳糖的异构体乳糖与阻抑蛋白结合,使阻抑蛋白的构象发生改变,不与操纵基因结合,失去阻抑作用,RNA 聚合酶可以操纵转录结构基因。

乳糖操纵子的激活调控,在既存在乳糖又缺乏葡萄糖时,cAMP 浓度高, cAMP-CAP 复合物浓度高,与 CAP 位点的结合效应强,对乳糖操纵子的调控效应强;当存在葡萄糖时, cAMP 浓度低,cAMP-CAP 复合物浓度低,与 CAP 位点的结合效应弱,对乳糖操纵子的调控效应弱。

6、以色氨酸操纵子为例论述原核生物转录终止的调控及其意义。

1.色氨酸操纵子的阻抑调控:色氨酸操纵子的阻抑蛋白是一个同二聚体。

当培养基中有大最色氨酸时,阻抑蛋白与色氨酸结合而改变构象,形成活性阻抑物,与操纵基因结合,阻抑结构基因转录,最终降低色氨酸的合成速度;当培养基中没有色氨酸时,游离的阻抑蛋白不与操纵基因结合,结构基因表达催化合成色氨酸的酶,最终提高色氨酸的合成速度2.色氨酸操纵子的衰减调控色氨酸操纵子的前导序列位于结构基因 trpE 与操纵基因 trp0 之间,含 162nt,包括四段特殊序列:序列 l 是编码序列,编码一个称为前导肽的 14 肽的第 10、1l 位氨基酸是两个连续的色氨酸;序列 2 和序列 3 存在互补序列,可以形成茎环结构;序列 3 和序列 4 也存在互补序列,可以形成茎环结构,该茎环结构之后有一段连续的 U 序列,所以是一个典刑的不依赖 p 因子的终止子结构,称为衰减子。

当色氨酸缺乏时,色氨酰 tRNA 供给不足,翻译前导肽的核糖体停滞于序列 l 的色氮酸密码子位点,序列 2 与序列 3 形成茎环结构,使序列 3 不能与序列 4 形成衰减子结构,后面的结构基因可以完全转录:当色氨酸充足时,色氨酰 tRNA 供给充足,核糖体快速翻译序列 1 合成前导肽,并对序列 2 形成约束,使序列 3 不能与序列 2 形成茎环结构,转而与序列 4 形成转录终止子结构——衰减子,使 RNA 聚合酶停滞于序列 4 之后,不能转录下游的结构基因。

从衰减机制的分析来看,它不仅能够把几种水平如 DNA 和 RNA 的构象变化、mRNA 上内部终止(衰减子的重建以及核糖体上 tRNA 对终止密码的识别等统一起来,严格控制表达,而且衰减子还可依细胞内某一氨基酸水平的高低而行止。

所以它是一种应答灵敏、调节灵活的多重调控方式就像在色氨酸操纵子中,阻遏作用与衰减机制一起协同控制其基因表达,显然比单一的阻遏负调控系统更为有效。

一方面,当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转变速度极低时.衰减系统能更迅速地作出反应,使色氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度;另一方面,若外源色氨酸浓度实在太低,细菌本身又没有其他的内源性色氨酸合成体系,以致细菌难以支持自身的生长时,就需要有衰减体系加以调节——通过不终止 mRNA 的合成来增加 Trp 酶的合成从而提高内源色氨酸的浓度。

7、重组 DNA 技术的基本过程。

(1获取目的 DNA:用限制酶从特定位点精确切割 DNA,获得待克隆的目的 DNA;(2选择载体:载体是一种能自我复制的小分子 DNA,比如质粒或病毒 DNA: (3构建重组 DNA:用连接酶将目的 DNA 与载体通过共价键连接,形成重组 DNA; (4将重组 DNA 导入合适的细胞,该细胞称为重组 DNA 的宿主细胞; (5筛选和鉴定含重组DNA 的宿主细胞8、双脱氧法(末端终止法进行 DNA 测序的原理。

首先,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的 DNA 分子;然后利用 DNA 聚合酶不能够区分 dNTP 和 ddNTP 的特性,使 ddNTP 参入到寡核苷酸链的3’-末端。

因为ddNTP 3’不是 -OH,不能与下一个核苷酸聚合延伸,从而终止DNA 链的增长。

9、PCR 的原理。

PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板 DNA 与引物的退火(复性:模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;③延伸:DNA 模板—将反应体系温度升高,DNA 聚合酶遵循碱基互补原则按引物5'→3'方向合成目的 DNA 模板新的互补链。

以上变性、退火、延伸三步反应为PCR 的一次循环。

每一次循环的产物可以再变性解链,作为下一循环的模板。

这样的循环一次。

目的 DNA 的拷贝数就增加一倍。

10、Southern 杂交的基本步骤。

1.提取 DNA,用限制酶切割,获得 DNA 片段混合物。

基因组DNA 很长,需要切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析。

2.通过琼脂糖凝胶电泳将 DNA片段按大小分离。

3.用碱处理电泳凝胶,将 DNA 片段原位变性解链。

4.将变性的 DNA 片段从凝胶转移到固相膜上。

5.用封闭物预杂交,然后漂洗除去未结合封闭物。

6.用探针杂交液浸泡同相膜,与待测 DNA 片段进行杂交。

7.用不同离子强度的溶液依次漂洗同相膜,除去未杂交探针和形成非特异性杂交体的探针。

8.通过显影或显色分析固相膜上的杂交体,将杂交体位臵和凝胶电泳图谱进行对比,可以计算待测 DNA 片段的分子量。