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实验1
实验2
分子生物学基本操作与训练 ；
感受态细胞的制备，
重组质粒导入大肠杆菌及重组子筛选 ；

实验3 实验4 实验5 实验6
重组质粒DNA的小量制备； 重组质粒DNA限制性内切酶的酶切与鉴定 ； 聚合酶链反应（PCR）及琼脂糖凝胶电泳； 基因组DNA的提取与鉴定；
复习
隆技术、DNA测序技术、PCR技术、核酸分子杂交技术、蛋 白质组研究技术和生物芯片技术等；

（3）应用篇：在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，
详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、 多基因疾病的分子诊断、移植配型、法医学鉴定、单核苷酸多 肽型分析以及生物信息学在分子诊断中的应用。
G C盒(-90)
RNA聚合酶与模板DNA的结合需一系列转录因子 ( TF )的参与。
RNA聚合酶
D F
A
TATA
B
E
DNA
真核生物的转录终止
—— 和转录后加工密切相关
mRNA
核酸酶
3’
5’ AATAAA GTGTGTG
Poly (A)
5’
RNA-pol
3’
转录终止的修饰点
真核生物的转录后加工
内含子（intron）和外显子（exon）
蛋白质的生物合成 —— 翻译
翻译（translation）
是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸的三联体遗传密
码翻译成氨基酸序列，合成多肽链的过程，是基因表达的最 终目的。
蛋白质生物合成体系
模板： mRNA
原料：20种编码氨基酸 氨基酸运载体：tRNA 场所：核蛋白体 酶：氨基酰-tRNA合成酶、 转肽酶
病毒双链DNA （cDNA第二链 用 表示）
反转录酶的作用
转录
(
transcription
)
生物体以DNA为模板合成RNA的过程
转 录 DNA
RNA
转 录 的 条 件：
原料 : 4种NTP ( ATP, UTP, GTP, CTP )
模板 :
酶 :
单链DNA
RNA聚合酶
其他蛋白质因子
复制与转录的异同?？
–同二聚体 (亚基22kD)，是一种重要转录调节蛋白。 –两个结合位点 • DNA结合域 • cAMP(cyclic AMP)结合位点
2、
乳糖操纵子(lac operon)的调控方式
RNA聚合 酶 无诱 导物时
i基 因
P
O
Lac Z
Lac Y
lac A
阻遏物 蛋白亚基
阻遏 蛋白
i基 因
有诱导物时
DNA的复制、转录和翻译 基因表达调控
DNA复制
概念:
半保留复制,半不连续复制(前导链, 后随链),冈崎片段 DNA复制的酶学
DNA聚合酶(DDDP,多功能酶)

起始阶段---获得单链模板
解螺旋酶,拓扑异构酶,单链结合蛋白等
反转录 ( reverse transcription )
的过程,也称逆转录 。
乳糖操纵子
调 控 序 列
P：启动子 O：操纵基因
结 构 基 因
Z：β-半乳糖苷酶基因 Y：通透酶基因
A：乙酰基转移酶基因

半 乳 糖 苷 酶 （ 细 菌 中 少 量 存 在 ）
细菌对乳糖的利用及其相关的酶: 乳糖 (在通透酶作用下进入细菌内）
β半乳糖苷酶
β
（细菌中少量存在）
异乳糖
β半乳糖苷酶
（细菌中少量存在）
反转录酶
以RNA为模板，合成与其互补的DNA
反转录酶（reverse transcriptase）
是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板， 4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为 反转录过程。反转录酶是多功能酶。
反转录酶的作用－合成cDNA：
① RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。 ② 核糖核酸酶H活性（RNaseH）。 ③ DNA聚合酶活性（DDDP）。

抑制转录

结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏
葡萄糖
mRNA从5’ → 3’方向，从起始密码到终止密码的序
列，称为一个开放阅读框架。
• 遗传密码（genetic codon）
开放阅读框架内每3个碱基组成的三联体，决定一个氨 基酸，称为遗传密码。
• 遗传密码的特点
（一）遗传密码的连续性（commaless） （二）简并性（degeneracy） （三）摆动性（wobble） （四）通用性（universal） （五）偏爱性
可调节转录的DNA片段。
－－非编码序列；包括启动子、增强子、终止子、沉默子等。
反式作用因子（trans-acting factor）－蛋白质 与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转 录活性的蛋白质因子。
包括转录因子，RNA聚合酶等。
反式作用因子（trans-acting factor）
激活蛋白(activator protein）
蛋白质因子：起始因子（initiation factors, IF;eIF）
延长因子（elongation factors, EF） 释放因子（release factors, RF） 核蛋白体释放因子（ribosomal release factors, RRF）
一、mRNA是翻译的直接模板
• 开放阅读框架（open reading frame ,ORF）
起始复合物:
RNApol - DNA - pppGpN- OH
DNA
5 3
RNA
RNA聚合酶
核糖体 原核生物转录过程中的现象
转录终止
------ RNA聚合酶在DNA模板上停止前进，
转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来
原核生物的转录终止子（terminator）
1、 依赖ρ因子（Rho) 的转录终止 2、不依赖ρ因子的转录终止
促进转录；
阻遏蛋白(repressor protein)
抑制转录；
RNA聚合酶
直接识别并结合启动子，解开DNA双螺旋，催化合成 转录产物；
第二节 原核生物基因转录调节
原核基因转录调节特点
操纵子模型的普遍性
–操纵子—一个转录单位
RNA聚合酶对转录起始的调节
调节蛋白对转录起始的调节
操纵子（operon）： 原核生物的一段DNA序列，由几个串联排列的功能相关的 结构基因，加上调控序列组成的一个完整的连续的功能单位。
RNA聚合酶
lacZ
lacY
lacA
转录
mRNA 翻译
阻遏蛋白
别乳糖
半乳糖苷酶 通透酶
乙酰转移酶
阻遏蛋白与别乳糖结合后构象发生了改变， 因而不能与操纵基因结合，使得结构 基因进行转录。
CAP的正调控（Positive
Control of CAP）
CAP(catabolite activator protein) —分解代谢基因激活蛋白
结合部位，影响启 动子复合物形成；
原核生物的转录起始
1 RNA聚合酶全酶 (2 ) 与模板结合 2 DNA双链解开,形成转录空泡 3 在RNA聚合酶作用下
发生第一次聚合反应 pppGpN pppG NTP OH
ppi
5’-pppG -OH + NTP
– 5’ -pppGpN – OH + ppi
3
RDDP RNase （核酸酶H活性) （反转录酶） 引物、4种dNTP 5 5 5 3
RNA (用 表示) RNA-DNA 杂化分子
3
5
3
DDDP （DNA聚合酶活性） 4种dNTP
5
3

5
3
5
3
与病毒RNA 互补的DNA (complementary DNA，cDNA ) (用 表示)
。
基因表达调控
基因表达(gene
expression)
-- 通过转录及翻译产生蛋白质产物，或转录后 直接产生RNA产物的过程。 基因表达调控（control of gene expression） 基因表达的开启或关闭以及基因活性的增加或减 弱等，受着调节和控制。
顺式作用元件（cis-acting element） －特异DNA序列
5 3 3 5
茎环结构使转录终止：
5’pppG
1，使RNA聚合酶变构 2，使转录复合物趋于解离，RNA产物释放
真核生物的转录起始
也需要RNA聚合酶辨认、结合转录起点
，生成起始复合物。
RNA聚合酶II启动子
基 因
-GCGC---CAAT---TATA
转录起始 增强子(enhancer ) 增强转录效率 CAAT盒(-75) TATA盒（-30～-25）
UAA UAG
UGA
AUG
二、核蛋白体是肽链合成的场所
核蛋白体由大、小亚基组成，每个亚基含有不同的 蛋白质和rRNA，原核生物和真核生物又各有不同。
SD序列（Shine-Dalgarno)
原核生物特有的、位于mRNA上起始密码子上游的一段 富含嘌呤（AGGA)碱基的短序列，是mRNA与核糖体小亚基 结合位点，直接影响翻译效率，又称为核蛋白体结合位点 （ribosomal binding site，RBS）。

control of
无乳糖(no lactose): lac操纵子处于阻遏状态 (repression)
乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时)
调节基因 启动子 操纵基因 结构基因
I
转录 mRNA
Ｐ
Ｏ
lacZ