absorbency
1 y = -0.14971 + 0.035786x R= 0.9954
0.8
0.6
0.4
0.2
glucose standard curve 1
0
0
5
10
15
20
25
30
glucose standard curve1
glucose chroma/10-4mol/l
另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线，得到下图2： 其回归方程为：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.
试管号
0
1
2
3
4
56
7
8
9
10
11
12
13
14
DNS/ml
0
2
2
2
2
22
2
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
葡萄糖/ml
0
0
1
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
浓度/104mol/l
3
5
7
9 11
13
15
17
19
21
23
25
27
下图1为葡萄糖标准曲线图，葡萄糖含量（mol/l） 与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归方程为： y = - 0.14971+0.035786x， R= 0.9954。
二.显色条件的选择
1. 波长选择 取5支试管按下表加相应溶液，沸水 浴15min, 均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不 同波长处分别进行扫描。
试管号 0
1
2
3
4
DNS/ml 0
2
2
2
1
水/ml 3
1
糖/ml 0
0
1
1
2
（10 -3mol/l）（10-4mol/l） （10-2mol/l)
定的DNS用量为2ml。
0.3
0.28
0.26
0.24
A
0.22
0.2
0.18
dosage of DNS
0.16
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
picture 3
dosage of DNS/ml
3.反应时间(水浴时间) 取试管按下表加相应溶液，
沸水浴相应时间后,加入7ml水定容为10ml，流水冷却， 以6号试管中的DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。
2 .5 y = -0 .1 0 48 3 + 0 .03 1 80 4x R = 0.99 8 17
2
absorbency
1 .5
1
0 .5
0 0
glucose standard curve
10
20
30
40
50
glucose standard curve2
60
70
80
g lu co se chro m a/10 -4m ol/l
DNS法测定还原糖的含量
@@
实 3，5-二硝基水杨酸溶液与还原 验 糖溶液共热后被还原成棕红色 原 的氨基化合物，在一定范实验 理 围内反应的还原糖的量和棕红
色物质颜色深浅的程度成一定 比例关系，可测定生成化合物 的吸光度，由标准曲线反推出 还原糖的浓度。操作简便，快 速，杂质干扰较少，适于生物 制氢中还原糖含量的测定。
试管号
0
1
2
3
4
5
6
7
DNS/ml
0
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
11*10-4mol/l葡萄
0
0
1
1
1
1
1
1
糖
PH
/
〉14
11
8
9
10
7
〉14
图5中的PH是用PH试纸调出的，该曲线只能反映变化趋势。 由图5可以看出，溶液的碱性越强，反应进行的越完全， 溶液的酸度越小，越有利于氨基化合物的生成。另外由于 DNS试剂就是用NaOH溶液配制的，单纯DNS与水的混合 液的PH值已经超过14。且DNS在反应中是过量的，反应时 间是足够长的，故测量时只需将被测溶液调至中性，无需 刻意调节反应混合物溶液的PH值，保证测量时DNS试剂、 糖的用量与制作标准曲线时相同即可。
煮沸时间为30min。
0.3 0.29 0.28 0.27
A
0.26
0.25 0
Time
10
20
30
40
50
60 Time/min
picture 4
4 反应溶液的酸度范围的选择
取试管按下表加相应试剂，由于所用器皿为试管，不方便用PH 计调节PH，此次实验采用加入不同量的6%的盐酸溶液的办法， 以PH试纸调节溶液的酸度。煮沸20min后，各加入7ml水定容 为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。
0.2
0.18
吸 光 0.16 度
0.14
0.12
λ/nm
A
0.1
wavelengh
0.08
510
520
530
540
550
560
570
Fig.2 4号试管稀释10倍后波长扫描
2.DNS用量选择 取试管按下表加相应溶液，沸水浴 30min, 加入适量水使定容为10ml，流水冷却，以1号
试管中DNS溶液为参比，在540nm处测吸光度。
图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。
由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄 糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分， 故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。
由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小， 这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。
试管号 0
1
2
3
4
5
6
7
DNS/ml 0
2
1
1.5
2
2.5
3
3.5
水/ml
3
1
11*
0
0
1
1
1
1
1
1
10-
4mol/l
葡萄糖
由图3可以看出溶液的吸光度随着DNS用量的增大而 增大，但当DNS用量达到3.5ml时，吸光度反而下降， 这说明DNS的用量不是越多越好，只要在与糖的反应中 DNS有剩余即可。如果DNS用量过多，会使测量时DNS溶 液浓度过大，造成测量不准。综合考虑，此次实验选
显色条件包括: 波长选择，显色剂用量， 显色时间，溶液酸度，显 色温度，有机络合物的稳 定性及共存离子的干扰等 。此次实验选择波长选择 ，显色剂用量，显色时间 ，溶液酸度进行实验。
一．试剂的配置
DNS试剂：称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水 中， 加热， 趁热加入0.6313g 3，5-二硝基水杨酸 （DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上 述溶液中，称量0.5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠 移入配置好的溶液中，蒸馏水定容至100ml，该试剂 避光保存7～10天。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-2mol/l）：准确称量0.1990g 无水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述102mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述103mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。
0.3
0.25
0.2
A
0.15
0.1
0.0
10
12
14
16 PH
picture 5
三． 标准曲线的建立
取试管按下表加相应试剂，由0.01mol/l葡萄糖标准液配 制x*10-4mol/l（3<=x<=27）的葡萄糖，煮沸30min后，各 加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在 540nm处测吸光度。
3.5
3
DNS+H O 2
2.5
DNS+10-3mol/l glucose
DNS+10-4mol/l glucose
2
amide
A
1.5
1
0.5
0
440 460 480 500 520 540 560 580
Fig.1
wavelengh/nm
图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图
4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS试剂反应，使 生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，仪器无法测定，故 将其稀释10倍。以水调零未出现最高峰，以DNS调零时（图2） 在540nm处有最高峰，这说明在该浓度下，DNS可能会对氨基 化合物吸光度的测量有较大影响，故测量时以DNS调零较准确 。选择540nm作为最佳吸收波长。
试管 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
号
DNS/ 0
2
2
2
2
2
2
2
2
2
ml
水
3
1
/ml
11*1 0
1
1
1
1
1
0
1
1
1